Различение пола и половой зрелости белуги Huso huso с помощью биопсии

Так как осетровые не имеют внешних признаков полового диморфизма, отсутствуют внешние маркеры для определения пола. Поэтому приходится исследовать гонады рыб. В данной работе описывается метод биопсии и гистологического рассмотрения гонад белуги (Huso huso) обоих полов на различных стадиях развития. Пол и зрелость 226 особей определялись путем биопсии гонад и анализа гистологических препаратов. Острым скальпелем через срединную линию на брюшной стороне тела производился 20-25 мм разрез между брюшным и грудным плавниками. Таким образом осуществлялся доступ к гонадам. Пол и зрелость были успешно определены у всех рыб. Соотношение полов в аквакультуре составляло 1:0,85 (самки: самцы). Большинство самцов и самок находились на стадии промежуточного сперматогенеза и превителлогенеза. После проведения хирургической операции и биопсии гонад случаев смерти не наблюдалось. Результаты работы показали возможность определения пола с помощью биопсии у 3-х годовалых и более взрослых особей. Таким образом, биопсия является недорогим и простым инструментом диагностики пола осетровых в рыбоводстве.

Осетровые являются древним семейством рыб, Acipensiriidae. Представители рода Acipenser обнаруживаются в Каспийском море. Наиболее крупный вид осетровых, белуга (Huso huso), является самым крупным видом евразийских пресноводных рыб, который дает наиболее ценную икру и мясо в мире. В природе требуется много времени для взросления белуги и достижения ей половой зрелости, 10-16 лет для самцов и 14-20 лет для самок. Средний размер и масса тела особей при первом нересте составляет 2 метра и 50 кг, соответственно. Определение пола рыб — сложная противоречивая задача, что связано с большой продолжительностью жизни, поздним взрослением и поздним первым нерестом, длительностью цикла гонад. Кроме того гаметы осетровых отличаются от гамет других рыб, благодаря наличию акросомы у сперматозоидов и многочисленных микропиле у ооцитов. В условиях рыбоводческого хозяйства определение зрелости гонад является сложной и экономически затратной операционной задачей. Так, самцы выращиваются лишь для получения мяса без костей, тогда как самки содержаться для получения икры, либо потомства.

Вторичные половые признаки у осетровых не выражены, поэтому определить пол путем непосредственного наблюдения за особями в преднерестовый период невозможно. Традиционным методом определения пола и готовности осетровых к размножению в рыбоводстве является инвазивный метод рассмотрения гонад или биоптата.

На сегодняшний момент существует несколько способов половой дифференцировки особей и их зрелости. К их числу относятся анализ плазмы крови и подсчет концентрации в ней стероидных гормонов, ультразвуковое сканирование, бороскоп, биопсия и другие новейшие техники, например, эндоскопия и лапароскопия. Ни один из этих них не является рекомендованным, потому что каждый имеет свои недостатки. Анализ крови занимает много времени, требует лабораторного оборудования, поэтому в полевых условиях непригоден. Ультразвуковая диагностика неинвазивная методка, результаты довольно точные и получаются быстро, однако оборудование дорогостоящее. Кроме того пользоваться данным методом может только квалифицированный персонал. Хотя бороскоп хороший инструмент для полевых исследований, он имеет некоторые ограничения, в частности, неспособность различать самцов от незрелых самок, а также потенциальную опасность повреждения воронкообразной створки яйцевода. Эндоскопия и лапароскопия более точные методы, но требуют дорогостоящего оборудования и опытного персонала с достаточным багажом знаний в области анатомии рыб.
Биопсия и гистологическое исследование гонад является традиционной техникой определения пола у рыб. Нелетальная биопсия гонад распространена в отношении осетровых и ряда других рыб. Эта процедура, хотя и является инвазивной, она обладает низким травматизмом и остается самым надежным способом определения пола и зрелости. Отсюда, целью данной работы является определение пола, половой зрелости и соотношения полов белуги при использовании биопсии гонад. В задачи входило определение точности и пригодности метода в полевых условиях.

Материалы и методы
Экспериментальные животные разведены в комплексе Бехешти по выращиванию и распространению осетровых рыб, Решт, Гилян, Иран. Через один день после вылупления личинки переносились в специальный цилиндрический бетонный бассейн и питались дафнией вплоть до рассасывания желточного мешка. После рассасывания мешка при массе 150 мг их переносили в земляные пруды. В земляных прудах в течение нескольких лет молодь питалась искусственным рационом, согласно их пищевым потребностям. До определения пола и половой зрелости особи выращивалась до 3 лет и более. Биопсия гонад использовалась для половой дифференцировки и оценки репродуктивного статуса рыб.

Процедура биопсии гонад
Данное исследование проводилось на двух фермах. В первом хозяйстве использовались 138 рыб в возрасте 6-14 лет. Перед операцией особей перемещали в большие бетонные емкости объемом 36 м2. Второе хозяйство предоставило 88 особей в возрасте 3-6 лет, которые отлавливались из бетонных цилиндрических бассейнов. После вылова белуги специальной сетью-ковшом она перемещалась из выростной емкости на рабочий стол с помощью носилок из парусины. Перед началом операции измерялись некоторые параметры, такие как длина тела и масса. Факторы среды (CF) рассчитывались по формуле: CF = W/L3 x 100, где W – масса, L — общая длина.

Острым скальпелем вдоль брюшной стороны делался разрез длиной 20-25 мм. Место надреза располагалось на основе данных Chapman (1989) для белого осетра (Acipenser transmontanus). Для определения пола проводилось макроскопическое исследование яичников и семенников, либо тонким пинцетом забирался небольшой участок ткани (5-8 мм). В данном случае пинцет аккуратно вводился в брюшную полость и достигал гонад. Образцы ткани обрезались острыми ножницами и фиксировались в растворе Буэна для дальнейшего гистологического исследования. Во время операции жабры оставались влажными. Раневая поверхность сшивалась одним или двумя простыми швами с помощью иглы и зажима. Наркотизация животного проводилась внутримышечно 5% раствором окситетрациклина на особь. Раневая поверхность дезинфицировалась раствором повидон-йода и спреем хлорамфениколом. Не использовалась глубокая анестезия.

Гистологическое исследование гонад
Образцы гонад хранились в растворе Буэна. После 48 часов они погружались в парафин, затем серию спиртов для дегидратации и очистки. Образец разрезался на тонкие срезы толщиной 6 мкм и окрашивался гематоксилином-эозином. Определение пола и оценка половой зрелости осуществлялась по приготовленным образцам под световым микроскопом.

Результаты
Из 226 проанализированных рыб 123 особи были самками и 103 – самцами (1:0,84). Пол 89,7% 3-годовалых, 95,4% 6-годовалых и 100% 14-летних особей успешно определен с помощью биопсии. Соотношение полов по возрастам составило: 1:0,45; 1:0,78; 1:1,23, соответственно. Соотношение самок и самцов значимо отличалось от ожидаемого 1:1 во всех возрастных группах. Не было значимых отличий среди возрастных групп у самцов и самок по массе, общей длине и CF, однако между группами наблюдалось различие по массе. Гистологический анализ показал, что определение пола у особей младше 1 года (менее 320 г) невозможен, однако после дифференцировки яичников и семенников пол уже можно идентифицировать. Согласно гистологических исследований, 3- и 6-ти годовалые самки находились на стадии превителлогенеза, когда наблюдается миграция ядра (зародышевый пузырек смещается к периферии ооцита и рассасывается). Ранний сперматогенез наблюдался у 3-годовалых самцов, промежуточный сперматогенез у 6-летних самцов и поздний сперматогенез в семенниках 14-летних особей.

Характеристики белуги различного возраста на основе биопсии.
Таблица 1. Характеристики белуги различного возраста на основе биопсии.

Ни одна особь не погибла после операции. Раны заживали в течение 3 недель.

Число исследованных рыб к возрасту и длине тела.
Рисунок 1. Число исследованных рыб к возрасту и длине тела.
Гистологический препарат гонады незрелой белуги неизвестного пола (масса 320 г)
Рисунок 2. Гистологический препарат гонады незрелой белуги неизвестного пола (масса 320 г)
Изображение световая микроскопии образцов зрелой самки
Рисунок 3. Изображение световая микроскопии образцов зрелой самки (парафиновые срезы, окрашивание гематоксилином и эозином). A: Ооцит на стадии превителлогенеза (pvo) и адипозная ткань (ad), B: увеличенный ооцит на стадии превиителлогенеза (zri: лучистый венец, zre: внешняя часть лучистого венца zona, gr:
гранулезные клетки, tl: тека, и yg: желточные гранулы)
Световая микроскопия образцов тестикулярной ткани зрелого самца белуги
Рисунок 4. Световая микроскопия образцов тестикулярной ткани зрелого самца белуги (парафиновые срезы, окраска гематоксилином и эозином). A: сперматогонии (ранний сперматогенез), и B: этап спермиации.

Обсуждение
Результаты продемонстрировали эффективность и пригодность гистологического анализа в определении пола и половой зрелости 3-летних белуг. При использовании биопсии точность достигала 96%. Таким образом, доказана более высокая точность анализа биоптата по сравнению с другими методами диагностики, например, измерения концентрации гормонов, использовании бороскопа, эндоскопа, лапароскопа.

Рассмотренный инвазивный метод совершенно безопасен для рыб. Он также не влияет на темпы последующего развития. Точность метода возрастает с взрослением и укрупнением изучаемых особей. Стоит отметить, что взятие образцов может быть затруднено у мелких особей, потому что зародышевая часть гонад и жировой ткани прикрыта стенкой тела.

Результаты продемонстрировали значимое расхождение соотношения полов 1:0,84 по сравнению с ожидаемыми 1:1. Иногда данный показатель изменяется в зависимости от условий выращивания при интенсивном разведении или условий окружающей среды. В настоящем исследовании белуг вариативность может быть обусловлена условиями интенсивного разведения и возрастным составом групп. Возможно, увеличение выборки приблизит соотношение полов к 1:1.

Гистологический анализ показал, что самки белуги в возрасте 3 и 6 лет находятся на стадии превителлогенеза, а особи в возрасте 14 лет – на стадии поствителлогенеза. Ооциты превителлогенеза можно распознать по росту первичных ооцитов, дифференцировке гранулезных клеток и началу секреции клеток лучистого венца. Кроме того, толстый лучистый венец и значительный рост ооцитов происходит на стадии поствителлогенеза. Ранний сперматогенез, промежуточный сперматогенез и поздний сперматогенез наблюдались у самцов белуги 3, 6 и 14 летнего возраста, соответственно. У большинства рыб на этапе раннего, промежуточного сперматогенеза и позднего сперматогенеза преобладали сперматоциты и сперматиды, соответственно. Герминальные клетки окружали канальцы на этапе раннего сперматогенеза, и прогрессия от ранних сперматоцитов до сперматид отмечалась во время сперматогенеза.

Резюмируя, к преимуществам биопсии относятся:
1. Непосредственное рассмотрение гонад
2. Быстрота выполнения процедуры
3. Практичный, точный и эффективный метод полевого анализа
4. Недорогой

Очевидно, что для проверки зрелости фолликулов и семенников необходима хирургическая операция. Кроме того, при выращивании осетровых рыб требуется разделение особей по полу. С этой целью можно использовать биопсию. С другой стороны, данная методика более инвазивная, чем эндоскопия или сонография.
——
Falahatkar, B; Akhavan, S. R; Tolouei Gilani, M. H.; Abbasalizadeh, A. Sex identification and sexual maturity stages in farmed great sturgeon, Huso huso L. through biopsy. Iranian Journal of Veterinary Research, Volume 14, Issue 2, 133-139. 2013

Реакция постоянных читателей:

Заметил ошибку, тык*:

 Orphus

Комментарии Вконтакте:

Добавить комментарий

Войти с помощью: 

Ваш e-mail не будет опубликован. Обязательные поля помечены *