Данная статья посвящена описанию патента на использование тест системы для определения пола ценных видов рыб.

Авторы предлагают адаптировать в рыбоводческой сфере диагностические наборы, нашедшие применение в медицине. В частности, предлагается использовать удешевленные варианты коммерческих наборов для количественного измерения концентрации ингибинов A и B, антимюллерова гормона.

Таким образом, принимая в расчет различия гормонального фона мужских и женских особей, особенности физиологии хрящевых рыб, а также адаптируя диагностические наборы, предназначенные для человека, авторы разработали методики определения пола коммерческих видов рыб. Предложенные методы были проверены экспериментально на Осетровых.

---

Предлагаемые авторами продукты используются для определения концентрации димеров ингибина A, которые является маркерами жизнеспособности плода и протекания беременности у человека. У женщин ингибины A и B секретируются в фолликулах, с возрастом их концентрация снижается, что свидетельствует о снижении овариального резерва. У мужчин ингибин В является маркером функции клеток Сертоли и экзокринной тестикулярной функции. Его концентрация у здоровых мужчин не носит циклических колебаний), но в патологических ситуациях, уровень ингибина В может быть снижен.

Помимо ингибинов, предлагается использовать методики количественного определения концентрации антимюллерова гормона. У мужчин АМГ синтезируется в яичках до периода полового созревания. В период наступления половой зрелости синтез гормона прогрессивно снижается и сохраняется на очень низком уровне. У женщин гормон вырабатывается с внутриутробного периода и до момента угасания половой функции, но до наступления периода половой зрелости уровень гормона низкий.

---

Полный текст патента с экспериментальными данными и графиками

Пол рыб определялся с помощью измерения концентрации одного из пептидных гормонов семейства трансформирующегося ростового фактора бета (TGF-β) в сыворотке, плазме или белой крови. Разработанный метод и сопутствующий набор диагностики могут использоваться в осетровом рыбоводстве для отбора молодых самцов. Метод и набор также применимы в целях изучения истории жизни диких особей.

Для определенных коммерческих видов рыб, таких как Осетровые (семейство Acipenseridae), взрослые самки имеют огромную ценность за их икру. Мясо самцов имеет ограниченное экономическое значение, и стоимость выращивания мужских особей до стадии половой зрелости может превышать ценность их мяса.

Различные виды Осетровых достигают половой зрелости в различном возрасте. Кроме того, внутри каждого вида наступление половой зрелости зависит от факторов, включающих доступность корма и его питательную ценность. Выращиваемые в неволе особи лучше питаются и быстрее растут, чем их дикие собратья. Поэтому они могут достигнуть зрелости раньше. Исследователи Рыбоводческого парка Морской лаборатории Моута (MAP) обнаружили, что самцы и самки Сибирского осетра в неволе достигают половой зрелости примерно к 5 годам, когда икра может собираться у самок. Сбор подразумевает вскрытие рыбы и непосредственное определение пола. Данный метод смертелен для осетра и предполагает выращивание их вплоть до достижения зрелости.

В рыбоводстве чрезвычайно полезным окажется неинвазивный способ определение пола молодых (например, в возрасте 3 лет и младше) самцов и самок. Он дает возможность рыбоводу отбирать молодых самцов и избегать затрат, обусловленных многолетним подращиванием малоценных мужских особей. Кроме того это позволяет сосредоточиться на выращивании более ценных самок и оптимизировать использование всего объема производственных мощностей. Известные нелетальные методы определения пола не имеют достаточной точности, сложны в использовании, особенно в отношении молоди.

В данной статье описывается методика определения пола, которая предполагает взятие крови у рыб; необязательное отделение плазмы или сыворотки крови; измерение концентрации одного или более пептидных гормонов семейства трансформирующегося ростового фактора бета (TGF-β) в сыворотке, плазме или самой крови; определение пола рыбы на основе результатов анализа. С помощью предлагаемого метода можно определить пол рыб, готовность к размножению, готовность к сбору икры и провести оценку факторов окружающей среды и других факторов, влияющих на созревание, половой отбор и проявление гермафродитизма. В частности, он позволяет с высокой точностью различить самцов и самок уже в раннем возрасте (для Сибирского осетра в 12 месяцев). Метод может применяться в качестве контроля ультразвуковой диагностики, когда пол рыб не был точно установлен.

Изобретение обеспечивает набор для полевых исследований, включающий портативное устройство из нескольких контактных мест, принимающее образцы крови, сыворотки и плазмы рыб и показывающее концентрацию пептидных гормонов. Каждое место контакта обеспечивает быструю реакцию связанных с ним антител или других индикаторов, которые предоставляют колориметрический и другие представления концентрации пептидных гормонов в течение 15 минут. При этом точность интерпретации результатов составляет 90% и более по сравнению с контрольным гистологическим анализом.

Метод может использоваться для определения пола различных, так называемых, костных рыб (класс Osteichthyes)

двух подклассов, Chondrostei и Teleostei, включая аквакультурные виды. Рыбы из подкласса Chondrostei, имеющие преимущественно хрящевой скелет с участками окостенения, включают следующие рода: Acipenser, Адриатический осётр (Acipenser naccarii), Амурский осётр (A. schrenckii), Атлантический осётр (A. oxyrinchus oxyrinchus), Байкальский осетр (A. baerii baicalensis), Балтийский или Европейский осетр (A. sturio), Китайский осетр (A. sinensis), Шип (A. nudiventris), Зеленый осетр (A. medirostris), Атлантический осетр мексиканского залива (A. oxyrinchus desotoi), Японский осетр (A. multiscutatus), Озерный осетр (A. fulvescens), Персидский осетр (A. persicus), Русский осетр (A. gueldenstaedtii), Сахалинский осетр (A.mikadoi), Тупорылый осётр (A.brevirostrum), Сибирский осетр (A. baerii baerii), Севрюга (A. stellatus), Стерлядь (A. ruthenus), Белый осетр (A. transmontanus), Корейский осётр (A.dabryanus); представители рода Huso: Белуга (Huso huso) и Калуга (Huso dauricus); представители рода Scaphirhynchus, такие как Алабамский лопатонос (S. suttkusi), Белый лопатонос (S. albus) и Обыкновенный лопатонос (S. platorynchus); представители рода Pseudoscaphirhynchus, такие как Амударьинский большой лопатонос (P. kaufmanni), Амударьинский малый лопатонос (P. hermanni), Сырдарьинский лопатонос (P. fedtschenkoi). Среди костных рыб подотряда Teleostei, которые имеют полностью окостеневший скелет, пол можно определить у Сомообразных (отряд Siluriformes), Обыкновенного помпано (Trachinotus carolinus), Груперов (подсемейство Epinephelinae), Морских окуней (род Sebastes), Лососевых (род Salmonidae), Люциана (Lutjanidae), Снук (различные виды, включая семейство Centropomidae). Предлагаемый метод может использоваться для изучения живых и мертвых, диких или искусственно-выращенных рыб. Он предназначен для исследовательских целей (например, изучение истории жизни диких особей), сохранения биоразнообразия, зарыбления, потребления и аквакультуры. Особая ценность метода заключается в определении пола незрелых живых рыб, например, среди искусственно-выращенных особей.

Предлагаемый набор реагентов применим для определения готовности особей к нересту. Например, самки Обыкновенного помпано созревают для нереста не синхронно. Метод позволяет отделить наиболее готовых рыб, либо провести селекцию особей на основе предполагаемого времени нереста.

Набор пригоден для оценки зрелости икринок. Если икринки будут собраны слишком рано или слишком поздно, их вкусовые качества пострадают. Более того, не потревоженная икра постепенно рассасывается внутри самки.

Разработанный метод может использоваться для оценки влияния факторов окружающей среды и других факторов, воздействующих на половое развитие, отбор и возникновение гермафродитизма. Он имеет особое значение для исследования диких и искусственно выращиваемых рыб.

С его помощью удобно измерять концентрацию множества пептидных гормонов семейства TGF-β. К числу этих веществ относятся: Антимюллеров гормон (AMH); костные морфогенетические белки 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8A, 8B, 10 или 15 (BMP2, BMP3, BMP4, BMP5, BMP6, BMP7, BMP8A, BMP8B, BMP10 или BMP15); ростовые факторы дифференцировки 1, 2, 3, 3A, 5, 6, 7, 8, 9, 10 или 11 (GDF1, GDF2, GDF3, GDF4, GDF5, GDF6, GDF7, GDF8, GDF9, GDF10 или GDF11); глиальный нейротрофический фактор (GDNF); ингибин A (INHA); ингибин B (INHB); ингибин βA, βB, βC и βE (INHBA, INHBB, INHBC или INHBE); факторы детерминации асимметрии (left right determination factor LEFTY 1 LEFTY 2); ростовые факторы трансформации β1, β2, β3 (TGF-β1, TGF-β2, TGF-β3); и комбинация любых двух ли более пептидных гормонов. Измерение концентрации двух и более гормонов обеспечивает более высокую точность у очень молодых рыб. Измерение концентрации одного, двух или всех AMH, ингибина A и ингибина B более предпочтительно, чем измерение концентрации ингибина A.

Измерение проводится различными коммерческими или экспериментальными методами, среди которых наиболее предпочтительны иммуноферментный анализ (EIA), иммуноферментный анализ с иммуносорбентами (ELISA). Наборы EIA и ELISA для человека и млекопитающих доступны на рынке, например Beckman Coulter (ACCESS Inhibin A Reagent Pack), Cell Signaling Technology, Diagnostic Systems Laboratories (Inhibin A ELISA kit), Enzo Life Sciences, Milipore Corp., Raybiotech, Inc., R&D Systems, Serotec Ltd (Ultra Sensitive Inhibin A Dimer Kit), Sigms-Aldrich Co. and USCN Life science Inc.

Протоколы и процедуры, разработанные производителями для исследования человека, во многих случаях, без изменений пригодны в отношении рыб, включая соответствующие стандарты и контроль. Например, из хвостовой вены рыбы можно отобрать 2 мл крови и провести анализ ELISA. Для живой рыбы желательно брать образцы крови без нанесения серьезных травм нелетальным способом. Лучше всего отделять сыворотку или плазму от цельной крови (например, с использованием центрифугирования или фильтрации) для получения 0,5 мл сыворотки или плазмы на каждую особь. Перед анализом биологические жидкости рыб можно хранить в холодильнике, либо морозильнике. Тем временем живую рыбу следует промаркировать, используя имеющиеся средства, пересадить в пруд, аквариум, и позднее отлавливать для обработки, если анализ показал желаемые результаты. Образцы крови, плазмы или сыворотки можно поместить в ячейки планшета для микротитрования, покрытых соответствующим антителами (например, антителами против AMH, ингибина A, ингибина B или других представителей семейства TGF-β). После инкубации и промывания для обнаружения антитела вносят субстрат (например, тетраметилбензидин) и перкосидазу хрена. Колориметрические изменения регистрируются по длине волны с использованием микропланшетного фотометра. При этом измеренная абсорбция будет прямо пропорциональна концентрации пептидного гормона в образце. Результаты интерпретируются для классификации рыбы на основе выбранного гормона и пола рыб. Например, при определении пола рыбы по ингибину A или B самцы осетра демонстрируют высокую концентрацию гормонов (например, более 10, более 15, более 100, более 200, более 300 пг/мл в зависимости от возраста), тогда как самки имеют низкие концентрации (например, ниже 300, ниже 200, ниже 100, ниже 15, ниже 10 пг/мл в зависимости от возраста). У Флоридского помпано самцы демонстрируют низкую концентрацию ингибина B (ниже 50 пг/мл), а самки – высокую (более 50 пг/мл). Анализ с использованием AMH менее точный, чем при измерении ингибина A или B. Самки имеют более низкие концентрации данного гормона, чем самцы. При измерении зрелости икры по уровню ингибина B его концентрация оказывается больше у рыб с икрой оптимальной зрелости, чем у самок без икры или с рассасывающейся перезрелой икрой. Оптимальное время сбора икры соответствует концентрации ингибина B от 20 пг/мл и выше.

[user]

Набор для проведения анализа по определению пола рыб должен быть оперативным (результат виден сразу). В нем не должно быть дорогостоящих и длительных промежуточных этапов, таких как выделение сыворотки или плазмы, замораживание сыворотки или плазмы, жидкостной химической обработки, маркирования рыб и возвращения и изъятие их из емкостей, сверка данных с данными лаборатории. Например, набор полевых исследований, включающий индикаторные полоски, может применяться в воде, где находится рыба. Этот набор годен для оценки концентрации пептидных гормонов в цельной крови, сыворотке или плазме непосредственно после отбора крови. Существующие на рынке наборы тестов требуют определенного времени для выполнения. Если это время превышает 15 минут, тогда биологический материал необходимо маркировать, рыбу также маркировать и отсаживать в отдельную емкость. Идеальная тест система обеспечивает высокую точность (90% и более по сравнению с гистологическими исследованиями) в короткие промежутки времени (менее 15, 12, 10, 8, 5 или 4 минут после взятия образцов крови, сыворотки или плазмы, а лучше 3, 2, 1 минут). Таким образом, непосредственно после взятия крови на анализ, рыба может находиться в сачке до момента получения результатов. Так как получение ложно положительного или ложно отрицательного результата в случае с рыбами не так опасно, как в случае с человеком, аквакультурная тест система может быть адаптирована с позиции повышения скорости её выполнения, удобства и удешевления.

Например, полевая тест система может быть портативным мультифункциональным устройством на 3, 5, 10, 15 или 20 образцов, принимающих кровь, сыворотку или плазму. Отдельные тест ячейки могут быть подвижными или прикрепленными друг к другу. Например, каждая из них может являться подвижным элементом, который удаляется и сменяться после использования так, что новые особи будут анализироваться свежим тестом. Тест ячейки могут располагаться в ряд, наподобие спичечного коробка, так, что набор можно держать в одной руке и пальцами сменять или удалять использованные ячейки. Тест система может содержать адсорбент или неадсорбирующую пленку, мембрану или связанные быстродействующие антитела (к AMH, ингибинам A и B и другим представителям семейства TGF-β). Для простоты презентации данных, результат может выражаться в символической форме (самец/самка). Набор может упаковываться в нестерильную и негерметичную упаковку для удешевления производства.

[/user]

Примеры использования системы c графиками и результатами

Пример 1. Образцы цельной крови брались у Сибирского осетра в возрасте 16 (график 1), 32 (график 2) и 39 (график 3) месяцев, выращенных в Рыбоводческом парке Морской лаборатории Моута (MAP). Образцы центрифугировались, и полученная сыворотка анализировалась с помощью теста ELISA (Beckman Coulter) для определения концентрации ингибина A. Особи умерщвлялись, и их пол определялся по гистологическим препаратам. Для 16 месячных особей гистологическому контролю подверглось 11 из 26 рыб; для 32 месячных особей – 14 из 35 рыб; для 39 месячных особей – 39 рыб.

На графиках показано, что для 16 месячных самок Сибирского осетра концентрация ингибина A составляла менее 13 пг/мл, а для 16 месячных самцов – выше 13 пг/мл. Более зрелые особи имели более высокую концентрацию ингибина, поэтому их пол было легче определить. Концентрация гормона 32месячных самок составила менее 350 пг/мл, а самцов – более 350 пг/мл. Самки в возрасте 39 месяцев имели концентрацию гормона ниже 50 пг/мл, а самцы – выше 50 пг/мл. Ультразвуковая диагностика пола не позволила точно идентифицировать пол, особенно у молодых особей.

Пример 2. Используя метод, описанный в примере 1, измерялась концентрация ингибина B, взятого у 3 и 5-летнего Сибирского осетра. Трехлетняя самка имела концентрацию гормона менее 15 пг/мл, а 3-летних большинство самцов – более 15 пг/мл (график 4). Пятилетние самки имели концентрацию менее 50 пг/мл, а самцы – более 50 пг/мл (график 5).

Пример 3. Используя метод, описанный в примере 1, измерялась концентрация ингибина B, взятого у 5-летнего Сибирского осетра (график 6). Из рыбы также получалась икра и оценивалась зрелость икры. Показано, что самки со зрелой икрой имеют концентрацию ингибина равную или чуть более 20 пг/мл.

Пример 4. Двое зрелые 5-летних осетра были протестированы с помощью ультразвукового сканирования и опознаны как самцы. Измеренная концентрация ингибина A составила 25,25 и 38,69 пг/мл, указывающих на то, что особи являются самками. Гистологическое исследование гонад подтвердило, что особи являются самками и показало ошибочность ультразвуковой диагностики.

Пример 5. Используя метод, описанный в примере 1, измерялась концентрация ингибина B и AMH в образцах крови, взятых у Флоридского помпано. Результаты продемонстрировали концентрацию ингибина B у самцов менее 50 пг/мл, а самок – более 50 пг/мл. Самки чаще всего имели концентрацию AMH ниже, чем самцы, с некоторым перекрытием диапазонов для особей различного возраста.

Пример 6. Используя метод, описанный в примере 1, измерялась концентрация ингибина A 1-1,5-годовалых Сибирских осетров. Особи, в крови которых концентрация составила менее 13 пг/мл, отбраковывались, а остальные доращивались для сбора икры. Затраты с использованием подобной стратегии отбраковки (с тестом ELISA) оказались ниже, чем выращивание всех особей до 3-4 летнего возраста.
——
Dana L. Wetzel, John E. Reynolds, William E. Roudebush. Fish sexual characteristic determination using peptide hormones. 19.09.2013. www.freshpatents.com/-dt20130919ptan20130244261.php