Так как осетровые не имеют внешних признаков полового диморфизма, отсутствуют внешние маркеры для определения пола. Поэтому приходится исследовать гонады рыб. В данной работе описывается метод биопсии и гистологического рассмотрения гонад белуги (Huso huso) обоих полов на различных стадиях развития. Пол и зрелость 226 особей определялись путем биопсии гонад и анализа гистологических препаратов. Острым скальпелем через срединную линию на брюшной стороне тела производился 20-25 мм разрез между брюшным и грудным плавниками. Таким образом осуществлялся доступ к гонадам. Пол и зрелость были успешно определены у всех рыб. Соотношение полов в аквакультуре составляло 1:0,85 (самки: самцы). Большинство самцов и самок находились на стадии промежуточного сперматогенеза и превителлогенеза. После проведения хирургической операции и биопсии гонад случаев смерти не наблюдалось. Результаты работы показали возможность определения пола с помощью биопсии у 3-х годовалых и более взрослых особей. Таким образом, биопсия является недорогим и простым инструментом диагностики пола осетровых в рыбоводстве.

Введение

Осетровые являются древним семейством рыб, Acipensiriidae. Представители рода Acipenser обнаруживаются в Каспийском море. Наиболее крупный вид осетровых, белуга (Huso huso), является самым крупным видом евразийских пресноводных рыб, который дает наиболее ценную икру и мясо в мире. В природе требуется много времени для взросления белуги и достижения ей половой зрелости, 10-16 лет для самцов и 14-20 лет для самок. Средний размер и масса тела особей при первом нересте составляет 2 метра и 50 кг, соответственно. Определение пола рыб — сложная противоречивая задача, что связано с большой продолжительностью жизни, поздним взрослением и поздним первым нерестом, длительностью цикла гонад. Кроме того гаметы осетровых отличаются от гамет других рыб, благодаря наличию акросомы у сперматозоидов и многочисленных микропиле у ооцитов. В условиях рыбоводческого хозяйства определение зрелости гонад является сложной и экономически затратной операционной задачей. Так, самцы выращиваются лишь для получения мяса без костей, тогда как самки содержаться для получения икры, либо потомства.

Вторичные половые признаки у осетровых не выражены, поэтому определить пол путем непосредственного наблюдения за особями в преднерестовый период невозможно. Традиционным методом определения пола и готовности осетровых к размножению в рыбоводстве является инвазивный метод рассмотрения гонад или биоптата.

На сегодняшний момент существует несколько способов половой дифференцировки особей и их зрелости. К их числу относятся анализ плазмы крови и подсчет концентрации в ней стероидных гормонов, ультразвуковое сканирование, бороскоп, биопсия и другие новейшие техники, например, эндоскопия и лапароскопия. Ни один из этих них не является рекомендованным, потому что каждый имеет свои недостатки. Анализ крови занимает много времени, требует лабораторного оборудования, поэтому в полевых условиях непригоден. Ультразвуковая диагностика неинвазивная методка, результаты довольно точные и получаются быстро, однако оборудование дорогостоящее. Кроме того пользоваться данным методом может только квалифицированный персонал. Хотя бороскоп хороший инструмент для полевых исследований, он имеет некоторые ограничения, в частности, неспособность различать самцов от незрелых самок, а также потенциальную опасность повреждения воронкообразной створки яйцевода. Эндоскопия и лапароскопия более точные методы, но требуют дорогостоящего оборудования и опытного персонала с достаточным багажом знаний в области анатомии рыб.
Биопсия и гистологическое исследование гонад является традиционной техникой определения пола у рыб. Нелетальная биопсия гонад распространена в отношении осетровых и ряда других рыб. Эта процедура, хотя и является инвазивной, она обладает низким травматизмом и остается самым надежным способом определения пола и зрелости. Отсюда, целью данной работы является определение пола, половой зрелости и соотношения полов белуги при использовании биопсии гонад. В задачи входило определение точности и пригодности метода в полевых условиях.

Материалы и методы

Экспериментальные животные разведены в комплексе Бехешти по выращиванию и распространению осетровых рыб, Решт, Гилян, Иран. Через один день после вылупления личинки переносились в специальный цилиндрический бетонный бассейн и питались дафнией вплоть до рассасывания желточного мешка. После рассасывания мешка при массе 150 мг их переносили в земляные пруды. В земляных прудах в течение нескольких лет молодь питалась искусственным рационом, согласно их пищевым потребностям. До определения пола и половой зрелости особи выращивалась до 3 лет и более. Биопсия гонад использовалась для половой дифференцировки и оценки репродуктивного статуса рыб.

Процедура биопсии гонад

Данное исследование проводилось на двух фермах. В первом хозяйстве использовались 138 рыб в возрасте 6-14 лет. Перед операцией особей перемещали в большие бетонные емкости объемом 36 м2. Второе хозяйство предоставило 88 особей в возрасте 3-6 лет, которые отлавливались из бетонных цилиндрических бассейнов. После вылова белуги специальной сетью-ковшом она перемещалась из выростной емкости на рабочий стол с помощью носилок из парусины. Перед началом операции измерялись некоторые параметры, такие как длина тела и масса. Факторы среды (CF) рассчитывались по формуле: CF = W/L3 x 100, где W – масса, L — общая длина.

Острым скальпелем вдоль брюшной стороны делался разрез длиной 20-25 мм. Место надреза располагалось на основе данных Chapman (1989) для белого осетра (Acipenser transmontanus). Для определения пола проводилось макроскопическое исследование яичников и семенников, либо тонким пинцетом забирался небольшой участок ткани (5-8 мм). В данном случае пинцет аккуратно вводился в брюшную полость и достигал гонад. Образцы ткани обрезались острыми ножницами и фиксировались в растворе Буэна для дальнейшего гистологического исследования. Во время операции жабры оставались влажными. Раневая поверхность сшивалась одним или двумя простыми швами с помощью иглы и зажима. Наркотизация животного проводилась внутримышечно 5% раствором окситетрациклина на особь. Раневая поверхность дезинфицировалась раствором повидон-йода и спреем хлорамфениколом. Не использовалась глубокая анестезия.

Гистологическое исследование гонад

Образцы гонад хранились в растворе Буэна. После 48 часов они погружались в парафин, затем серию спиртов для дегидратации и очистки. Образец разрезался на тонкие срезы толщиной 6 мкм и окрашивался гематоксилином-эозином. Определение пола и оценка половой зрелости осуществлялась по приготовленным образцам под световым микроскопом.

Результаты

Из 226 проанализированных рыб 123 особи были самками и 103 – самцами (1:0,84). Пол 89,7% 3-годовалых, 95,4% 6-годовалых и 100% 14-летних особей успешно определен с помощью биопсии. Соотношение полов по возрастам составило: 1:0,45; 1:0,78; 1:1,23, соответственно. Соотношение самок и самцов значимо отличалось от ожидаемого 1:1 во всех возрастных группах. Не было значимых отличий среди возрастных групп у самцов и самок по массе, общей длине и CF, однако между группами наблюдалось различие по массе. Гистологический анализ показал, что определение пола у особей младше 1 года (менее 320 г) невозможен, однако после дифференцировки яичников и семенников пол уже можно идентифицировать. Согласно гистологических исследований, 3- и 6-ти годовалые самки находились на стадии превителлогенеза, когда наблюдается миграция ядра (зародышевый пузырек смещается к периферии ооцита и рассасывается). Ранний сперматогенез наблюдался у 3-годовалых самцов, промежуточный сперматогенез у 6-летних самцов и поздний сперматогенез в семенниках 14-летних особей.

Ни одна особь не погибла после операции. Раны заживали в течение 3 недель.

Обсуждение

Результаты продемонстрировали эффективность и пригодность гистологического анализа в определении пола и половой зрелости 3-летних белуг. При использовании биопсии точность достигала 96%. Таким образом, доказана более высокая точность анализа биоптата по сравнению с другими методами диагностики, например, измерения концентрации гормонов, использовании бороскопа, эндоскопа, лапароскопа.

Рассмотренный инвазивный метод совершенно безопасен для рыб. Он также не влияет на темпы последующего развития. Точность метода возрастает с взрослением и укрупнением изучаемых особей. Стоит отметить, что взятие образцов может быть затруднено у мелких особей, потому что зародышевая часть гонад и жировой ткани прикрыта стенкой тела.

Результаты продемонстрировали значимое расхождение соотношения полов 1:0,84 по сравнению с ожидаемыми 1:1. Иногда данный показатель изменяется в зависимости от условий выращивания при интенсивном разведении или условий окружающей среды. В настоящем исследовании белуг вариативность может быть обусловлена условиями интенсивного разведения и возрастным составом групп. Возможно, увеличение выборки приблизит соотношение полов к 1:1.

Гистологический анализ показал, что самки белуги в возрасте 3 и 6 лет находятся на стадии превителлогенеза, а особи в возрасте 14 лет – на стадии поствителлогенеза. Ооциты превителлогенеза можно распознать по росту первичных ооцитов, дифференцировке гранулезных клеток и началу секреции клеток лучистого венца. Кроме того, толстый лучистый венец и значительный рост ооцитов происходит на стадии поствителлогенеза. Ранний сперматогенез, промежуточный сперматогенез и поздний сперматогенез наблюдались у самцов белуги 3, 6 и 14 летнего возраста, соответственно. У большинства рыб на этапе раннего, промежуточного сперматогенеза и позднего сперматогенеза преобладали сперматоциты и сперматиды, соответственно. Герминальные клетки окружали канальцы на этапе раннего сперматогенеза, и прогрессия от ранних сперматоцитов до сперматид отмечалась во время сперматогенеза.

Резюмируя, к преимуществам биопсии относятся:
1. Непосредственное рассмотрение гонад
2. Быстрота выполнения процедуры
3. Практичный, точный и эффективный метод полевого анализа
4. Недорогой

Очевидно, что для проверки зрелости фолликулов и семенников необходима хирургическая операция. Кроме того, при выращивании осетровых рыб требуется разделение особей по полу. С этой целью можно использовать биопсию. С другой стороны, данная методика более инвазивная, чем эндоскопия или сонография.
——
Falahatkar, B; Akhavan, S. R; Tolouei Gilani, M. H.; Abbasalizadeh, A. Sex identification and sexual maturity stages in farmed great sturgeon, Huso huso L. through biopsy. Iranian Journal of Veterinary Research, Volume 14, Issue 2, 133-139. 2013