Замедление образования биопленки вибрионов в лабораторных условиях и профилактика AHPND у креветок путем добавления в корм экстракта имбиря

Подобно большинству других бактерий, возбудителей заболевания у человека и животных, специфические изоляты Vibrio parahaemolyticus образуют колонии и формируют биопленку на хитине, выстилающем желудок креветок, а затем высвобождают  токсины, разрушающие гепатопанкреас. Бактерия V. parahaemolyticus вызывает синдром острого гепатопанкреатического некроза (AHPND) у креветок семейства Penaeidae. Недавние эксперименты показали, что этанольный экстракт имбиря (Zingiber officenale) останавливает распространение биопленки бактерий AHPND в лабораторных условиях, но не препятствует их росту.

Если вместе с кормом креветки получали экстракт имбиря, выживаемость особей после заражения бактериями AHPND увеличивалась на 40-60% по сравнению с инфицированными креветками, получавшими обычный корм. Авторы работы предполагают, что для лечения или снижения негативных эффектов бактерий AHPND, вместо вредных для организма антибиотиков, можно использовать замедляющие формирование биопленки соединения, экстракт имбиря.

Бактериальные биопленки и заболевания

Биопленка или конгломерат бактерий, расположенный на какой-либо поверхности, — это наиболее предпочтительная среда обитания для большинства бактерий. Биопленки характеризуются бактериальными клетками, которые необратимо прикрепляются к субстрату и погружаются в скопление внеклеточных полимерных веществ. Обитание в структурированных конгломератах биопленок позволяет бактериям размножаться быстрее. По оценкам Национального института здравоохранения США более 80% всех бактериальных заболеваний человека и животных связаны с бактериальными биопленками. Вибрионы бактерии, включая изоляты, вызывающие AHPND, также образуют биопленки в хитиновых кутикулярных тканях кардиального отдела желудка креветок. После этого бактериальные клетки вырабатывают и выделяют токсины PirA и PirB, разрушающие соседние гепатопанкреатические клетки. В итоге это приводит к гибели креветок и синдрому ранней смертности.

Для профилактики и лечения AHPND использовали несколько стратегий, включая прием антибиотиков, несмотря на все недостатки этого метода. Самая серьезная проблема с использованием антибиотиков заключается в том, что лекарства часто способствуют появлению устойчивых к антибиотикам бактерий. В настоящее время это одна из наиболее важных глобальных угроз для здоровья населения. Кроме того, страны-импортеры нередко отказываются от или вводят запрет на зараженные антибиотиками креветки и продукты, содержащие креветочное мясо.

Чтобы избежать проблем, связанных с приемом антибиотиками, мы исследовали возможность использования экстрактов растительных материалов, которые не убивают патогенные бактерии и не замедляют их рост, однако препятствуют образованию бактериальной биопленки в организме или на теле хозяина. Эти растительные экстракты первоначально проверили в лабораторных условиях на их способность препятствовать образованию биопленки бактерии штамма V. parahaemolyticus 3HP (V_AHPND) в бульоне Мюллера Хинтона (MHB), содержащем 1% глицерина и 1,5% NaCl, но не самому росту планктонных клеток бактерий. Проверка нескольких растительных экстрактов показала, что этанольный экстракт имбиря обладает необходимыми свойствами для лечения и профилактики V_AHPND.

Замедление формирования биопленки из бактерий AHPND, а не их размножения

Сначала для получения этанольного экстракта имбиря сухой порошок корневищ имбиря (20 г) экстрагировали 95% этанолом (300 мл) с помощью аппарата Сокслета, установленного на 78°C в течение примерно 14 часов. Растворитель (этанол) затем удалили из экстракта, полученного с помощью роторного испарителя, установленного при 42°C, в результате чего получался вязкий желтовато-коричневый материал (2,74 г). На выходе получили 137мг/г (13,7%) порошка имбиря.

Потом полученный концентрированный экстракт разводили в диметилсульфоксиде (40 мг/мл) и далее разбавляли стерильной дистиллированной водой до достижения конечных концентраций 20 мг/мл и 2 мг/мл для использования в исследованиях роста клеток вибрионов, исследованиях замедления формирования биопленки и экспериментах с кормами. Конечные разбавленные препараты (20 мкл/лунка) добавляли к бульону бактериальной культуры (180 мкл бактериальной культуры, полученной из ночной культуры, разбавленной той же средой, какая используется для культивирования бактерий, но в этом случае дополненная средой MHB с 1,5% хлоридом натрия) и измеряли оптическую плотность разбавленных клеток (оптическая плотность при 600 нм). Культуру разбавляли до тех пор, пока в микротитровальных пластинах не получили оптическую плотность, равную 0,01. Конечная концентрация достигнута при 0,2 мг экстракта имбиря или 2 мг экстракта имбиря.

Культуры биопленок поместили в инкубатор при 30°С без перемешивания на всю ночь, после чего образовавшиеся биопленки окрашивали кристаллическим фиолетовым красителем и измеряли их толщину по показанию оптической плотности при O.D. 600 nm. Чем выше показания, тем толще образованные биопленки. Аналогичную экспериментальную установку также подготовили для определения способности экстракта замедлять рост планктонных клеток V_AHPND. Бактерии культивировали в открытой пластине с использованием среды бульона Мюллера-Хинтона (MHB) с 1,5% NaCl и инкубировали в течение ночи при 30°C с перемешиванием при 200 об/мин.

В качестве индикатора роста клеток использовали поглощение света при 600 Нм. Обнаружили, что экстракт имбиря в обеих концентрациях существенно препятствует образованию биопленки V_AHPND, но не росту бактерий, поэтому также протестировали экстракт имбиря в более низких концентрациях: 400 мкг/мл, 300 мкг/мл, 200 мкг/мл и 100 мкг/мл. Все концентрации прошли проверку и получили положительный результат (Рисунок 1 и 2). Для получения более подробной информации об используемых протоколах и результатах см. Soowannayan et al. (2019), публикация в журнале «Aquaculture» 504, стр. 139-147.

Корм с добавками позволил снизить смертность креветок после инфекции V_AHPND

В дальнейшем экстракт имбиря смешивали с коммерческим кормом для креветок в пост-личиночной стадии (в двух различных концентрациях: 0,2 мг/г и 2 мг/г корма) и тестировали на трех группах белоногих креветок Penaeus vannamei в течение 7 дней, прежде чем креветок погрузили в раствор с V_AHPND при 10⁵CFU/мл. Мы продолжали кормить креветок тем же кормом, в то время как контрольные креветки получали корм без добавок в течение еще 9 дней. За это время проводился сравнительный анализ их здоровья и уровня смертности.

Полученные результаты позволили установить, что корм с добавлением имбиря в концентрации 2 мг/г или 0,2 мг/г защищает белоногих креветок от инфекции V_AHPND. Средняя выживаемость креветок, получавших корм с добавлением экстракта имбиря, составила 50,0% и 42,5% соответственно, что на 42,5% и 35% выше, чем у  инфицированных креветок, получавших корм без добавок (выживаемость 7,5%). Выживаемость контрольной группы составила 92,5% (Рис. 3). Гистопатологическое исследование гематоксилина и эозина (H&E), менее тяжелых патологий AHPND у инфицированных креветок, корм которых содержал экстракт имбиря (Рис.4).

В ходе исследования мы также обнаружили, что не существует никакого очевидного отрицательного влияния экстракта имбиря на вкусовые качества корма или на рост креветок. Три потенциально биологически активных соединения, входящие в состав экстрактов имбиря (6-гингерол, 8-гингерол и 6-шогаол) также протестированы на эффективность замедления образования биопленки в лабораторных условиях. Лучшие результаты показал 6-шогаол. Ни одно из этих биологически активных соединений не оказывало влияния на рост бактерий в бульоне. Результаты этого исследования показали, что использование имбирных или других кормовых добавок, препятствующих образованию биопленок, может стать практическим методом снижения негативного воздействия AHPND на креветочных фермах.
——
Chumporn Soowannayan. Inhibition of Vibrio biofilm formation by ginger extracts. Aqua Culture Asia Pacific. Volume 15 Number 4 July/August 2019 MCI (P) 008/10/2018 ISBN 1793 -0561