Дифференцировка гонад у гермафродитов Русского и Сибирского осетра

За последний век мировое выращивание Осетровых существенно возросло. Эта тенденция коррелирует с резким снижением улова диких особей в Каспийском море [1]. Аквакультура Осетровых рыб развивается повсеместно, не только из-за запросов рынка, но также с целью рекреации популяции [1–3]. Выращивание в аквакультуре или сохранение дикой популяции требуют знание всех аспектов репродуктивной биологии Осетровых рыб. С точки зрения воспроизводства осетров в настоящее время особый интерес вызывает возрастание числа интерсексуальных особей в дикой и искусственной популяциях. Хотя репродуктивная стратегия многих видов рыб рассматривает появление гермафродитов в качестве нормы [4], данный феномен у Осетровых рыб считается патологией [5]. Интерсексуальные особи имеют женскую и мужскую герминальную ткани в гонадах. У осетров, как и всех гонохористичных видов рыб, интерсексуальность явление редкое. Однако оно отмечено у различных видов: Русский осетр (Acipenser gueldenstaedtii) [7, 8], Acipenser sturio [7], бестер (Huso huso х Acipenser ruthenus) [9], Атлантический осетр (Acipenser oxyrhynchus) [10, 11], Тупорылый осётр (Acipenser brevirostrum) [10, 12], стерлядь (Acipenser ruthenus) [13].

Гонохоризм — раздельнополость. Пол четко дифференцирован на протяжении всей жизни

Частота появления интерсексуальности в диких популяциях различных видов Осетровых обычно низкая и не превышает 3% от общей численности популяции [11, 14–16]. Однако, в некоторых исследованиях приводятся более высокие значения: 11,6% в популяции Тупорылого осетра из рек Купер и Делавэр [16], 29% самцов Белого лопатоноса (Scaphirhynchus albus), популяции реки Миссисипи [15]. У диких популяциях присутствие интерсексуальных особей часто связано с загрязнением воды веществ эндокринных разрушителей [15–17]. Их механизм действия заключается в перекрытии сигнальных путейэндогенных гормонов [18]. Эндокринные разрушители включают дихлордифенилтрихлорэтан (ДДТ), полихлорированные дифенилы (ПХБ), бифенол A, полибромированные дифенилэфиры и фталаты [19]. Высокий уровень продуктов распада ПХБ и ДДТ в мясе и икре Белого лопатоноса коррелировал с высокой частотой интерсексуальных особей среди самцов в дикой популяции реки Миссисипи [15]. Популяция Белого осетра (Acipenser transmontanus) в реке Колумбия были обнаружены три интерсексуальные особи. В гонадах и печени этих рыб присутствовали продукты метаболизма ДДТ, ПХБ и другие пестициды. Также отмечается отрицательная корреляция между концентрацией андрогенов и эндокринных разрушителей в плазме крови [20]. Интерсексуальные осетры также появляются в аквакультуре. Подобно диким популяциям, их частота обычно низкая (менее 5%) [12, 13, 21]. Согласно литературным данным, высокая встречаемость (14%) отмечена только для Русского осетра [8].

Гонадогенез различных видов Осетровых рыб активно описывается многими авторами [12, 22–28]. Однако дифференцировка и развитие интерсексуальных гонад, важные вопросы репродукции, остаются малоизученными. В данной статье рассмотрены результаты работы, в которой на макроскопическом и микроскопическом уровнях описаны дифференцировка интерсексуальных гонад на ранних стадиях развития. В ней изучены различные морфологические изменения, происходящие в ходе развития интерсексуальных гонад. Таким образом, предлгается классификация для характеристики всех типов определенных трансформаций гонад.

Материалы и методы
Условия содержания

Личинки Русского осетра (Acipenser gueldenstaedtii) и Сибирского осетра (Acipenser baerii) получены с частного рыбоводческого хозяйства «RYBA» в Олеснице, Польше. От 3 дней после вылупления и до 2 лет особи выращивались на кафедре Ихтиологии и Рыбоводства Варшавского Университета Естественных наук. Личинки и молодь содержались в 5 литровых стеклянных аквариумах с плотностью посадки 7 особей на литр. Аквариум оборудован системой рециркуляции воды, аэрцией, УФ- и биофильтрами. Поддерживался постоянный 12/12 фотопериод. С 30 дня развития рыбу пересаживали в емкости с рециркуляцией воды. Плотность посадки не превышала 2 кг/м2. С 8 дня развития, после рассасывания желточного мешка и появления меланиновой пробки, вплоть до 20 дня рыба питалась науплиями артемии (Artemia salina) в количестве 15% от биомассы рыб в день в 12 эквивалентных дозах. Начиная с 20 дня осетры получали коммерческий корм (Skretting). С 20 дня (средняя масса малька 0,16 г) использовался экструдированный стартовый корм для морских рыб (Perla Larva Proactive 6.0–4.0). Когда мальки достигали массы 0.5 г, рацион постепенно сменялся на Nutra 3.0–1.9, а при массе сеголеток 15 г — использовался корм Estella 1P-XL. Рацион вносился ежедневно в 10 равными порциями с помощью автоматической кормушки. Ежедневное количество корма рассчитывалось согласно Kolman [29]. Средняя температура воды в аквариумах и емкостях составила 20.7 C 0.78 C, pH 7.6 0.2, концентрация растворенного кислорода 7.9 0.3 мг/л. Измерения pH и температуры воды производились ежедневно с помощью WTW pH 3110 SET-2 pH-метра (WTW Wissenschaftlich-Technische Werksta?tten GmbH) и WTW Oxi 3205 SET-3 метра (WTW Wissenschaftlich-Technische Werkstatten). Выживаемость осетра в течение первых 30 дней составила 70,7%; позднее смертность не наблюдалась.

Меланиновая пробка — структура появляется у личинок осетра в заднем кишечнике после рассасывания желточного мешка и является индикатором начала кормления.

Сбор образцов
Гонады 58 особей Русского и 61 особи Сибирского осетра брались 8 раз на различных этапах выращивания. Перед забором особь наркотизировалась MS-222 (этил 3 — аминобензонат метансульфоната; Sigma-Aldrich) и декапитировались. Между особями одного возраста существовали различия в развитии, они делились на три группы, согласно этапу развития гонад. Ранняя дифференцировка включала особей на 100-200 днях развития, когда началась дифференцировка гонад и на основе гистологического анализа можно было определить пол. Промежуточная дифференцировка включала особей 200-400 дня развития, когда запускался митоз сперматогониев в семенниках и ранние этапы оогенеза в яичниках. Стадия формирования включала особей 400-800 дней развития, когда полностью сформировался герминальный эпителий семенников и яичников.

Гистологический анализ
Для проведения стандартной процедуры гистологического исследования гонады фиксировались в растворе Боуина (Sigma-Aldrich) и помещались в парафин. С помощью микротомов Leica RM2265 (Leica Microsystems) препараты нарезались на срезы толщиной 5 мкм. Определение пола проводилось после окрашивания раствором иодной кислоты-Шиффа/метанил жёлтый-гематоксилином Вайгерта (periodic acid-Schiff/metanil yellow-Weigert hematoxylin (PAS/MY-H))[30]. Формирование базальных мембран в ходе развития и дифферецировка герминального эпителия визуализировались по методу Gordon и Sweets [31] для окрашивания ретикулиновых волокон. Оригинальный метод был изменен использованием контрастирующего 2% водного раствора метилового зеленого (POCH S.A.) в течение 15 секунд вместо Ядерного красного быстрого (Nuclear Fast Red). Формирование герминального эпителия описывалось на основе критериев Grier [32].

Статистический анализ
Для сравнения полового соотношения в популяциях Осетровых использовался Хи-тест. Анализ проводился в программе R software environment, версии 2.15.3 (R Development Core Team, 2013).

Результаты
Развитие и дифференцировка гонад. Макроскопическое исследование

Макроскопическое рассмотрение гонад Русского (A, B, и D) и Сибирского осетра (C, E, и F).

Рисунок 1. Макроскопическое рассмотрение гонад Русского (A, B, и D) и Сибирского осетра (C, E, и F). A) Недифференцированная гонада на ранней стадии развития (100–130 дней после вылупления). B) Гонада на промежуточной стадии развития (200–400 дней после вылупления) покрыта жировой тканью. C) Яичник на промежуточной стадии развития (200–400 дней). D) Семенник на промежуточной стадии развития (200–400 дней). E) Гонада «Семенник-яичник» в начале стадии формирования (400–500 дней). F) Гонада «Яичник-семенник» в конце стадии формирования (700–800 дней). Жировая ткань (белые стрелки), женская герминальная ткань (черная стрелка), мужская герминальная ткань (красная стрелка). Масштаб = 20 мм.

Гонады особей обоих видов видны уже на ранних стадиях развития (100-300 дней) в виде пары тонких образований, тянущихся вдоль дорсальной стенки вентральной полости, параллельно почкам. В это время вдоль гонад, преимущественно с передней части, появляется небольшое количество жира. На промежуточной стадии дифференцировки (200-400 дней развития) жир виден вдоль всей гонады. Количество жира отличается у особей, от изобилия (по объему больше, чем герминальная часть гонад) до редкого. Адипозная ткань часто пигментирована, но выраженность пигментации различна среди особей. В ходе промежуточной стадии герминальные области гонад имеют особенности, связанные с полом. Овариальная ткань темнее и гетерогенее, со складчатой поверхностью (мелкие поперечные трещинки, зачастую с одной глубокой впадиной параллельной длинной оси гонады), тогда как тестикулярная ткань светлее и более однородная, с гладкой поверхностью. Размер герминальной ткани различается среди особей, но обычно яичники крупнее, чем семенники. На стадии формирования (400-800 дней) определение пола макроскопически возможно практически у всех особей, и результаты совпадали с данными гистологии. Однако эта стадия не всегда позволяла диагностировать гермафродитов. Их точная идентификация возможна только, когда герминальная часть тестикулярной и овариальной ткани в интерсексуальной гонаде достаточно хорошо развились. Как правило на ранней и промежуточной стадиях дифференцировки макроскопическое исследование определяло интерсексуальных особей как самцов, а семенники-яичники определялись путем гистологического анализа. Макроскопически, гермафродиты диагностировались начиная с 500 дней развития осетра. Интерсексуальные гонады обычно демонстрируют морфологию одного пола с включением другого пола, в одной, либо чаще обоих гонадах. Доля мужской и женской герминальной ткани у отдельных интерсексуальных особей варьирует. Начиная с периода формирования (400-500 дней развития), ткань самцов обычно преобладает (семенник-яичник), но позднее соотношение смещается, и доля овариальной ткани начинает превалировать (яичник-семенник). Макроскопически не удается провести различие в структуре ткани гонад у двух видов Осетровых. Однако отмечаются особенности отдельные размера герминального участка, степени ожирения и пигментации гонад.

Развитие и дифференцировка гонад. Микроскопический анализ
Дифференцировка эпителия интерсексуальных гонад на ранней стадии развития. Гистологическое исследование позволяет определить начало дифференцировки гонад у обоих видов Осетровых уже на ранней стадии развития (100-130 дней). Первым морфологическим признаком дифференцировки яичников является появление изгибов в столбчатом эпителии, покрывающим поверхность гонад. Герминальные клетки, расположенные спереди столбчатого эпителия, в молодых яичниках были собраны в гнезда оогониев на стадии митоза.

Микроскопический анализ гонад Русского (A, B, D, и F) и Сибирского осетра (C и E)

Рисунок 2. Микроскопический анализ гонад Русского (A, B, D, и F) и Сибирского осетра (C и E). A и B) Дифференцировка интерсексуальных гонад на ранней стадии развития (100–130 дней после вылупления). C) Интерсексуальная гонада в конце ранней стадии дифференцировки (170–200 дней). D) Интерсексуальная гонада в середине ранней стадии дифференцировки (130–170 дней). E) Субэпителиальное оогониальное гнездо в женской части интерсексуальной гонады в конце ранней стадии дифференцировки (170–200 дней). F) Субэпителиальные гнезда с ооцитами в мейозе в женской части интерсексуальной гонады в конце ранней стадии дифференцировки (170–200 дней). A, C, D, и F) PAS/MY-HE окрашивание. B и F) Окрашивание по Гордону и Свиту. поздние примордиальные герминальные клетки (PGC), складки на поверхности гонады (черная стрелка), внутритканевые кластеры герминальных клеток окруженных базальной мембраной (белые звезды), узлы на поверхности гонад покрыты столбчатым эпителием (черные стрелки), субэпителиальные кластеры герминальных клеток (белые стрелки), сперматогоний (S), мезорхий/мезовариум (M), субэпителиальные гнезда оогониев окруженных базальной мембраной (N), гнезда ооцитов на ранней стадии мейоза (NO). Масштаб = 100 мкм.

Поверхность молодых семенников, напротив, оставалась гладкой, а поверхность эпителия состояла преимущественно из кубоидальных и столбчатых клеток. Тестикулярная герминальная область содержала мало сперматогониев, тогда как в области около мезорхиума (mesorchium, брыжейка, на которой подвешены гонады) сперматогонии формировали продольные тяжи. Начиная с ранней стадии дифференцировки, интерсексуальные гонады развивались как в семенники, так и в яичники. Однако эти изменения сложно распознать, потому что между сперматогониями и оогониями нет видимых различий, а также в герминальной ткани присутствуют недифференцированные поздние примордиальные герминальные клетки. Начиная с ранней стадии дифференцировки (100-130 дней), интерсексуальные гонады демонстрируют борозды на поверхности гонад и аггрегаты герминальных клеток в области мезорхиума/мозовария. Эти трансформации сопровождаются гистологической моделью, больше похожей на развитие семенников. На поздних стадиях ранней дифференцировки (100-130 дней) интерсексуальные гонады четко видны и состоят, главным образом, из развивающегося мужского герминального эпителия с типичной для самок поверхностью гонад. Такие гонады имеют многочисленные изгибы и узлы, покрытые кубическим эпителием, что типично для яичников. Под базальной мембраной поверхности эпителия гонад видны отдельные кластеры герминальных клеток. Мужская часть гонад занимает центральную и мезорхиум/мозовариальную части, где свободно располагаются сперматогонии. В конце ранней стадии дифференцировки (170-200 дней) большинство огониев в интерсексуальных гонадах формируют гнезда, окруженные базальной мембраной. Эти клетки подвергаются мейозу с последующим развитием ооцитов в женской части гонад. Формирование базальных мембран, окружающих гнезда оогониев (являются расширениями базальной мембраны рядом с поверхностью эпителия гонад), необходимо для полного развития женского герминального эпителия в интерсексуальных гонадах. В тоже время, развитие мужского герминального эпителия существенно отстает, что типично для дифференцировки семенников. К промежуточной стадии и стадии формирования интерсексуальные гонады демонстрируют значительную морфологическую изменчивость, вследствие различия времени, степени и расположения трансформаций. Среди особей существенно различаются степень возникающих изгибов, число и распределение мужских и женских клеток.

Дифференцировка интерсексуального герминального эпителия на промежуточной стадии и стадии формирования
В ходе промежуточной стадии развития (200-400 дней) и этапа формирования (400-800 дней) интерсексуальные гонады определяются по присутствию, наряду с герминальными клетками, специфичными для одного пола, по меньшей мере, одного типа герминальных клеток от другого пола. Протекание этих стадий сопровождается прогрессивным развитием мужских и женских интерсексуальных гонад, что приводит к появлению обоих типов герминального эпителия в одной гонаде. По окончании стадии формирования (650-800 дней) в овариальной ткани обнаруживаются ооциты в стадии первичного ооцита, а в тестикулярной ткани — сперматозоиды внутри полости семиниформных канальцев. Развитие ооцитов внутри женского герминального эпителия на стадии формирования останавливается на этапе диплотены первого мейотического деления, и начинают развиваться фолликулы. Мужская часть гонад состоит из развивающихся семиниформных канальцев, окруженных базальной мембраной, со сперматоцистами или просветом канальцев, наполненных сперматозоидами. Как часть детального морфологического описания развития интерсексуального герминального эпителия проводилась количественная оценка трансформации и её локализации в интерсексуальных гонадах.

Количественные изменения
Морфологические изменения в интерсексуальных гонадах (трансформации) считались единичными (на промежуточной стадии и стадии формирования 5% и 29,6% для гермафродитов Русского и Сибирского осетра, соответственно) или массивными (на промежуточной стадии и стадии формирования 95% и 70,4% для гермафродитов Русского и Сибирского осетра, соответственно). При единичных трасформациях одиночные женские герминальные клетки были рассеяны между преобладающей тестикулярной тканью. На ранней стадии дифференцировки единичные трансформации невозможно увидеть, потому что под световым микроскопом оогонии и сперматогонии похожи. Гонады с единичными трансформациями обычно имеют преимущественно мужской герминальный эпителий, поэтому демонстрируют тестикулярную морфологию (семенник-яичник). Их поверхность остается гладкой на всех стадиях развития. На стадии формирования герминальный эпителий самца состоит из открытых семиниформных канальцев и отвечает всем требованиям для эпителия. Женская часть интерсексуальных гонад имеет единичные трансформации, включающие ооциты (на стадиях пахитены и диплотены), присутствуют на различных участках: примыкают к поверхности эпителия гонад или глубоко в строме, среди сперматогониев и сперматоцитов. Анализ участков гонад, где отмечались единичные ооциты среди тестикулярной ткани, не выявил контакта между фолликулами и поверхностью эпителия гонад. Таким образом, женская овариальная ткань не формируют законченного герминального эпителия и не способна к овуляции. В случае расположения ооцитов вдоль поверхности эпителия гонад формировался герминальный эпителий и самцов и самок.

Микроскопический анализ интерсексуальных гонад

Рисунок 3. Микроскопический анализ интерсексуальных гонад Сибирского (A, B, F, G, I, и K) и Русского осетра (C, D, E, H, и J) на промежуточной стадии (200-400 дней) и формирования (400-800 дней). A) Единичные внутритканевые трансформации на промежуточной стадии. B) Единичные внутритканевые трансформации на стадии формирования. C) Единичные субэпителиальные трансформации на промежуточной стадии. D) Массивные субэпителиальные трансформации на промежуточной стадии. E) Массивные внутритканевые трансформации на промежуточной стадии. F) Рассеяные массивные внутритканевые трансформации на промежуточной стадии. G) Миграция эпителиальных клеток с поверхности в герминальную область тестикулярной ткани. H) Массивные субэпителиальные трансформации — женская часть. I) Массивные субэпителиальные трансформации на стадии формирования. J) Массивные субэпителиальные трансформации на промежуточной стадии — женская часть располагает латерально к мужской части гонады. K) Массивные субэпителиальные трансформации на стадии формирования — узкая полоска женской части тянется параллельно длинной оси поверхности гонад. A, B, D, E, G, и J) PAS/MY-HE окрашивание. C, F, H, I, и K) Окрашивание по Гордону и Свиту.<br />Тестикулярная ткань (TC), овариальная ткань (Oc), открытые цисты семиниформных канальцев (Co), закрытые цисты семиниформных канальцев (Cc), ооциты (O), гладкая поверхность гонад (черные стрелки), формирование изгиба (белая стрелка), складки (F), мезорхий/мезоваиум (M), гнезда оогониев и ранние ооциты окруженные базальной мембраной (N), префолликулярные клетки (Pf), сперматозоид (Sz), гнезда оогониев (черные звезды), развивающиеся овариальные фолликулы (белая звезда) соединены с эпителиальной поверхностью гонады за счет расширения базальной мембраны. Масштаб = 100 мкм (A–K) или 50 мкм (вставка в A).

В интерсексуальных гонадах гораздо чаще формировались массивные трансформации, чем одиночные. При массивной трансформации в одних и тех же участках гонад присутствовало много женской и мужской герминальной ткани. Эти изменения хорошо диагностировались уже на ранней стадии дифференцировки. Женские компоненты обнаруживались преимущественно около отдельных изгибов поверхности эпителия, и они формировали женский герминальный эпителий на свободной поверхности гонад. Мужской герминальный эпителий обычно прилегал мезорхий/мезовариуму. Однако у некоторых индивидов рапределение герминальных компонентов варьировало. В этих редких случаях женские компоненты отмечались в мезорхий/мезовариуме, либо распределялись среди тестикулярной ткани. Соотношение женской и мужской герминальной ткани в интерсексуальных гонадах варьировало от особи к особи. При этом степень зрелости овариальной или тестикулярной тканей не отличалось от нормальных гонад. Результаты гистологического анализа показали взаимосвязь между возрастом гермафродитов и количеством трансформаций в обоих видов осетров. В конце стадии формирования (650-800 дней) гонады интерсексуальных особей обычно содержали больше овариальной, чем тестикулярной ткани (яичник-семенник).

Расположение трансформаций
На основе локализации трансформаций в гонады их классифицировали на: внутритканевые (35% у Русского и 37% у сибирского осетров на промежуточной стадии и стадии формирования), либо субэпителиальные (65% у Русского и 63% у сибирского осетров на промежуточной стадии и стадии формирования). Внутритканевые изменения включали присутствие единичных ооцитов в тестикулярной ткани, либо массивные изменения при врастании женской ткани в различные участки тестикулярной ткани, но без контакта с базальной мембраной поверхности эпителия гонады. В данном типе трансформации интерсексуальные гонады имели гладкую поверхность, свойственную для семенников, а женские компоненты (кластеры оогониев и единичные ооциты) располагались в строме или прилегали к мезорхий/мезовариуму. У рыб с внутритканевой трансформацией тестикулярная ткань образовывала законченный герминальный эпителий, тогда как женские компоненты были неполными (недостаточно связей с поверхностью гонад). С другой стороны, массивные внутритканевые трансформации в ходе развития овариальной ткани приводили к перемещению префолликулярных клеток от поверхности эпителия навстречу дифференцирующимся женским герминальным клеткам, расположенным интерстициально. Так образовывались изгибы и связи женского эпителия с поверхностью гонад.

Субэпителиальные массивные трансформации были наиболее распространенными морфологическими изменениями, происходящими в интерсексуальных гонадах обоих полов (60% у Русского и 59,3% у Сибирского осетров на промежуточной стадии и стадии формирования). Данный тип трансформации приводит к развитию обширной овариальной ткани под эпителиальной поверхностью гонад. Единичные субэпителиальные трансформации очень редкие. Развитие массивных трансформаций это длительный процесс, протекающий с ранней стадии дифференцировки. В данном типе трансформации, благодаря расширению базальной мембраны, овариальная ткань всегда соединена с эпителиальной поверхностью гонад, которая имеет изгибы. Такое расположение обоих типов герминальной ткани приводит к полному формированию женского и мужского герминального эпителия. Соотношение овариальной и тестикулярной тканей и их мозаичная композиция в интерсексуальных гонадах с массивными трансформациями чрезвычайно вариабельна. Это делает невозможным разграничение гонад на семенник-яичник или яичник-семенник. В некоторых случаях герминальный эпителий самок тянется от поверхности гонад через строму к мезорхий/мезовариуму, тогда как мужская ткань располагается латерально к женской. У других особей развитие овариальной ткани ограничивается узкой полоской вдоль длинной оси гонады, тогда как тестикулярная ткань занимает центральную область и/или прилегает к мезорхий/мезовариуму.

Интерсексуальные гонады имеют многочисленные области, содержащие различные типы трансформаций, даже внутри одной гонады. У одной особи Русского осетра гистологический анализ показал полную смену пола. Её гонада имела типичную для яичника морфологию, но расположение различных компонентов, присутствие крупных атипичных гнезд ооцитов на стадии пахитены, атипичных кластеров ооцитов на стадии первичного ооцита в мезорхий/мезовариуме и существенные различия стадий развития герминальных клеток указывали на, вероятно, запущенный процесс феминизации. Атипичные гонады также присутствовали у некоторых особей Сибирского осетра на промежуточной стадии. Гистологический рисунок этих гонад характеризуется деформированными изгибами на их поверхности, многочисленными полосами премордиальных герминальных клеток (обычны для ранней стадии дифференцировки) и недостатком более зрелых герминальных клеток.

Микроскопический анализ гонад

Рисунок 4. Микроскопический анализ гонад Русского (A–C) и Сибирского (D и E) осетра. A) Герминальная область атипичного яичника подвергась смене пола. B и C) Крупные кластеры ооцитов в мезорхий/мезовариуме атипичного яичника подвергшегося смене пола. D and E) Неклассифицированные/атипичные гонады на промежуточной стадии развития (200–400 дней). PAS/MY-HE окрашивание. Гнезда ооцитов на стадии пахитены (стрелки), кластеры крупных ооцитов (OC), мезорхий/мезовариум (M), деформированные изгибы (стрелки), полосы поздних примордиальных герминальных клеток (PGC). Масштаб = 100 мкм.

Половая структура популяций
Оценка половой структуры популяций Русского и Сибирского осетров основывается на гистологическом исследовании с подразделением всех особей на основе трех стадий развития гонад. Представители этих видов не имели статистически значимых различий в соотношении полов (тест хи-квадрат P = 0.9). Вследствие малого числа наблюдений, из анализа исключены особи, которых невозможно классифицировать. Сорок интерсексуальных особей, по 20 каждого вида, обнаружено среди осетров. Их присутствие отмечено на всех стадиях развития, и они составляют примерно 30% от всей популяции и >70% самцов (включает всех гермафродитов и самцов, в семенниках которых обнаружены трансформации). Самцы с полностью нормальными семенниками составляют лишь 10% любой популяции.

Стадии Возраст Выборка Неизвестен пол (%)* Самцы (%) Самки (%) Гермафродиты (%) +
Русский осетр
Ранняя 100–200 14 7.1 28.6 28.6 35.7
Промежуточная 200–400 30 0.0 6.7 53.3 40.0
Формирование 400–800 14 0.0 7.1 71.4 21.4
Общее 58 1.7 12.1 51.7 34.5
Сибирский осетр
Ранняя 100–200 14 21.4 7.1 64.3 7.1
Промежуточная 200–400 30 16.7 3.3 40.0 40.0
Формирование 400–800 17 0.0 23.5 35.3 41.2
Общее 61 13.1 9.8 44.3 32.8

Таблица 1. Половая структура Русского и Сибирского осетра на трех стадиях развития.
* Неопределенные по полу особи в связи с недостаточной дифференцировкой герминальной ткани на ранней стадии, либо атипичной структуры гонады на промежуточной стадии.
+ Гермафродиты — % интерсексуальных особей среди всех особей.

Обсуждение
Данные частоты встречаемости интерсексуальных особей в аквакультуре чрезвычайно скудны по сравнению с дикими популяциями. Даже, когда в культуре встречаясь в культуре, они представляют малую часть популяции [12, 13]. Лишь в одной работе докладывалось о высокой доле гермафродитов у разводимого Русского осетра [8]. Поэтому примечательны 30% гермафродитов для каждого вида, полученных в данном исследовании. Как овариальная, так и тестикулярная ткани гермафродитов были полностью функциональными. Это также было продемонстрировано у стерляди и тупорылого осетра в ходе успешного скрещивания и самооплодотворения [13, 21]. Гермафродиты в дикой популяции пагубно влияют на генетическое разнообразие, а самооплодотворение является крайней степенью инбридинга. Однако отсутствуют данные, подтверждающие случаи самооплодотворения Осетровых в дикой природе. В условиях аквакультуры высокий уровень гермафродитизма может привести к сложностям мониторинга состава полов выводка и пагубно скажется на формировании однополой группы для производства икры. Согласно различных авторам, к факторам, вызывающим развитие интерсексуальных гонад, относятся генетические предпосылки [8, 13], условия окружающей среды (термический стресс [8]), наличие в воде веществ эндокринных разрушителей [8]. В данной работе схожая частота встречаемости гермафродитов у обоих видов осетров позволяет исключить влияние генетических факторов. Обращаясь к факторам окружающей среды также нельзя объяснить высокую частоту гермафродитов в этом исследовании. Среди природных факторов наибольшее влияние на смену пола рыб оказывает температура [33]. Подъем температуры при выращивании рыб, пол которых зависит от температуры, может вызвать преобладание самцов [33, 34]. В данном исследовании осетры выращивались в воде с относительно высокой температурой (примерно 20 C). Если пол осетровых рыб зависит от температуры (такая зависимость научно не подтверждена) самцов будет больше. Тем не менее, мужские особи составляли лишь 10% в любой из двух популяций. Высокая частота гермафродитизма не объясняется термическим стрессом, потому что на поддерживалась на неизменном уровне. Мы также исключаем воздействие веществ эндокринных разрушителей, потому что рыба выращивалась в емкостях с подводом водопроводной воды. Используемые в рационе коммерческие корма вряд ли содержали эти соединения. Тем не менее, так как специальный анализ корма не проводился наличие эндокринных разрушителей нельзя исключать.

Большинство коммерческих кормов содержат высокобелковые компоненты, такие как соевые бобы [35]. Соевые бобы богатый источник фитоэстрогенов, веществ со слабой эстрогенной активностью, которые связываются с эстрогеновыми рецепторами и способны вызывать синтез вителлогенина у Осетровых рыб [36, 37]. Рацион, используемый в данном исследовании содержал большое количество соевых бобов, которые могли вызвать повышение уровня фитоэстрогенов. Рециркуляция воды в системе могла учились хроническое влияние этих соединений. Поэтому за формирование интерсексуальных гонад, возможно, ответственны фитоэстрогены, хотя их прямой эффект на развитие данной патологии у Осетровых научно не подтвержден. С другой стороны, имеются свидетельства того, что генистеин, один из основных фитоэстрогенов соевых бобов, вовлечен в развитие гермафродитизма некоторых других рыб, например, гуппи (Poecilla reticulata) [38] и канального сома (Ictalurus punctatus) [39]. Наличие генистеина и эквола в воде также запускает интерсексуальные трансформации у Медаки (Oryzias latipes) [40]. Действие фитоэстрогенов на различные виды рыб очень специфично и может приводить как к феминизации, так и к маскулинизации [38–40]. Это вариабельность генистеина обусловлена тем, что фитоэстрогены являются агонистами эстрогенов и андрогенов [41]. Умеренные концентрации (изофлавоны) в корме, использованные для стимуляции нереста Осетровых, оценивались в данной работе с помощью газовой хроматогорафии и составили 27,6-228,5 мг/кг (как сумма эквола, формононетина, биоханина A, даидзеина и генистеина). Генистеин, интерсекс-вызванная активность которого доказана, составляет 52-70% от всех фитоэстрогенов в рационе. Вышеотмеченные вещества также в значительных количествах обнаружены в крови и тканях животных (Roszko и Rzepkowska, неопубликованные данные).

С целью углубления знаний в данном исследовании впервые изучалась дифференцировка интерсексуальных гонад на ранней стадии развития осетров. Ранние работы сосредотачивались только на рассмотрении взрослых гермафродитов [8, 11, 12, 16, 21, 42]. В большинстве литературных источников, также как и по результатам этого исследования, отмечено как двустороннее, так и асимметричное распределение трансформаций в гонадах [8, 9, 16, 21]. Результаты гистологического анализа ранних работ схожи с полученными данными, и отмечают развитие одиночных [11, 12, 16] и массивных трансформаций. В последнем случае формируется значительное количество тестикулярной и овариальной тканей [8, 16, 21, 42]. Дифференцировка герминального эпителия интерсексуальных гонад у Осетровых включает различные морфологические изменения, которые приводят к изменчивости расположения и объема тестикулярнй и овариальной тканей среди у гермафродитов. авторы данной работы продемонстрировали, что массивные субэпителиальные трансформации, наиболее распространенные у обоих видов, начинаются под поверхностью эпителия гонад, который преимущественно имеет внешний вид тестикулярной ткани. Области массивных суюэпителиальных трансформаций укрупняются с взрослением рыб и перемещаются близко с мезорхий/мезовариуму. Здесь они формируют структуры, похожие на «пакеты ламелл», описанных Matsche и Rosemary [16]. Согласно критериям Крига [32], данный тип морфологии позволяет формироваться полностью в одной гонаде как тестикулярной, так и овариальной тканям.

Авторы этой работы отметили низкую частоту встречаемости единичных и внутритканевых трансформаций. Отсутствие массивных внутритканевых трансформаций у гермафродитов на поздних стадиях развития овариальной ткани и отсутствие литературных свидетельств подобных трансформаций указывает на переходный характер этих изменений. Они наблюдаются при взрослении рыб и, вероятно, становятся массивными субэпителиальными от проникновения префолликулярных клеток. Поэтому гонады приобретают характерные изгибы. Развитие единичных ооцитов в преимущественно тестикулярной ткани также отмечено Flynn и Benfey [12] и Van Eenennaam, Doroshov [11]. Частота встречаемости одиночных трансформаций не поддается подсчету, потому что они видны лишь под микроскопом. Это ограничение может привести к неправильному отнесению гонад как истинных семенников. Более того, одиночные ооциты, которые подвергаются внутритканевой дифференцировке не формируют законченного овариального герминального эпителия, соединенного с поверхностью гонад. Они не овулируют, а скорее уходят в атрезию.

Динамика дифференцировки и развития интерсексуальных гонад, вместе с половой структурой популяций обоих видов, указывают на то, что трансформация ведет к феминизации. Макроскопический и микроскопический анализ продемонстрировал неуклонную, длительную феминизацию, ведущую к полной смене пола, по крайней мере, в одном случае. Подобный эффект может быть обусловлен слабым, но продолжительным действием фактора. Два обстоятельства указывали на феминизацию как ведущий процесс. Во-первых, примерно половину особей обеих популяций составляли самки с нормальными яичниками, что обычно для Осетровых [43], тогда как отмечалась нехватка нормальных самцов. Во-вторых, развитие всех интерсексуальных гонад протекало от преобладания семенниковой ткани (семенник-яичник) на ранней стадии дифференцировки, поэтому макроскопически особи относились к самцам. Процесс перехода гонад с преобладанием овариальной ткани происходил по мере взросления особей. Таким образом, гонады «яичник-семенник» впервые обнаруживались на стадии формирования. Протекание массивных трансформаций подтверждается результатами гистологических исследований. У старых особей преобладает скопление женской герминальной ткани, тогда как доля тестикулярной снижается (яичник-семенник). Эти наблюдения свидетельствуют о том, что рано появившаяся субэпителиальная ткань развивается на обширную площадь гонад. Однако неясно, является ли это укрупнение овариальной ткани взрослых рыб результатом увеличения самих ооцитов, либо также обусловлено возрастанием числа участков трансформации. Если агент феминизации действует продолжительное время, возможны оба варианта. Сперматогонии гонохористичных рыб (например, радужной форели) обладают пластичностью и способны преобразовываться в оогонии [44]. Поэтому, преобладающие на тестикулярной фазе развития сперматогонии, могли начать трансформироваться в оогонии после наступления феминизации. Изобилие измененной герминальной ткани также может отражать силу и длительность действия агента феминизации. Авторы продемонстрировали, что этот фактор (или кумулятивное действие нескольких факторов) было слабым, потому что лишь в одном случае произошла полная смена пола. У большинства гермафродитов отмечалась частичная трансформация (от ранней «семенник-яичник» до поздней «яичник-семенник»). Так как феминизация протекала постепенно и необратимо у обоих видов осетров, трансформирующий фактор, вероятно, действовал непрерывно. Авторы склонны считать, что этим агентом являются кормовые фитоэстрогены. Однако для выяснения точных механизмов влияния необходимы дополнительные эксперименты с различными кормами (с различной концентрацией фитоэстрогенов и профилем рациона).
——
Rzepkowska M, Ostaszewska T, Gibala M, Roszko M.L. Intersex gonad differentiation in cultured Russian (Acipenser gueldenstaedtii) and Siberian (Acipenser baerii) sturgeon. Biol Reprod. 2014; 90 (2) : 31.

[user]1. Bronzi P, Rosenthal H, Gessner J. Global sturgeon aquaculture production: an overview. J Appl Ichthyol 2011; 27:169–175.
2. Chebanov M, Billiard R. The culture of sturgeons in Russia: production of juveniles for stocking and meat for human consumption. Aquat Liv Resourc 2001; 14:375–381.
3. Williot P, Sabeau L, Gessner J, Arlati G, Bronzi P, Gulyas T, Berni P. Sturgeon farming in Western Europe: recent developments and perspectives. Aquat Liv Resourc 2001; 14:367–374.
4. Sadovy I, Shapiro DY. Criteria for the diagnosis of hermaphroditism in fishes. Copeia 1987; 1987:136–156.
5. Atz JW. Intersexuality in fishes In: Armstrong CN, Marshall AJ (eds.), Intersexuality in Vertebrates Including Man. London, UK: Academic Press; 1964:145–232.
6. Yamamoto T. Sex differentiation In: Hoar WS, Randall DJ (eds.), Fish Physiology, vol. 3. New York: Academic Press; 1969:117–175.
7. Ziemiankowski B. A case of hermaphroditism in the Russian sturgeon (Acipenser gueldenstaedtii Brandt) [in German]. Zeitschr Fischerei Hilfswiss 1954; 3:235–236.
8. Jackson K, Hurvitz A, Yom Din S, Goldberg D, Pearlson O, Degani G, Levavi-Sivan B. Anatomical, hormonal and histological descriptions of captive Russian sturgeon (Acipenser gueldenstaedtii) with intersex gonads. Gen Comp Endocrinol 2006; 148:359–367.
9. Chirkina A. Reproductive glands of the hybrid of white sturgeon and starlet. Dokl Biol Sci Sect Zool 1957; 114:620–623.
10. Atz JW, Smith CL. Hermaphroditism and gonadal teratoma-like growths in sturgeon (Acipenser). Bull South Calif Acad Sci 1976; 75:119–126.
11. Van Eenennaam JP, Doroshov SI. Effects of age and body size on gonadal development of Atlantic sturgeon. J Fish Biol 1998; 53:624–637.
12. Flynn SR, Benfey TJ. Sex differentiation and aspects of gametogenesis in shortnose sturgeon, Acipenser brevirostrum Lesueur. J Fish Biol 2007; 70: 1027–1044.
13. Williot P, Brun R, Rouault T, Pelard M, Mercier D, Ludwig A. Artificial spawning in cultured sterlet sturgeon, Acipenser ruthenus L., with special emphasis on hermaphrodites. Aquaculture 2005; 246:263–273.
14. Chapman FA, Van Eenennaam JP, Doroshov SI. The reproductive condition
of white sturgeon, Acipenser transmontanus, in San Francisco Bay,
California. Fish Bull 1996; 94:628–634.
15. Harshbarger JC, Coffey MJ, Young MY. Intersexes in Mississippi River shovelnose sturgeon sampled below Saint Louis, Missouri, USA. Mar Environ Res 2000; 50:247–250.
16. Matshe MA, Rosemary KM. Reproductive demographics, intersex, and altered hormone levels in shortnose sturgeon, Acipenser brevirostrum, from Delaware River, USA. J Appl Ichthyol 2012; 29:299–309.
17. Mills LJ, Chichester C. Review of evidence: are endocrine-disrupting chemicals in the aquatic environment impacting fish populationsSci Total Environ 2005; 343:1–34.
18. Swedenborg E, Ru?egg J, Ma?kelaS, Pongratz I. Endocrine disruptive chemicals: mechanisms of action and involvement in metabolic disorders. J Mol Endocrinol 2009; 43:1–10.
19. Centers for Disease Control and Prevention. Fourth National Report on
Human Exposure to Environmental Chemicals. Washington, DC: US Department of Health and Human Services; 2009.
20. Feist GW, Webb MAH, Gundersen DT, Foster EP, Schreck CB, Maule AG, Fitzpatrick MS. Evidence of detrimental effects of environmental contaminants on growth and reproductive physiology of white sturgeon in impounded areas of the Columbia River. Environ Health Perspect 2005; 113:1675–1682.
21. Henne JP, Ware KM, Wayman WR, Bakal RS, Horva?th A. Synchronous hermaphroditism and self-fertilization in a captive shortnose sturgeon. T Am Fish Soc 2006; 135:55–60.
22. Akhundov MM, Fedorov KY. Early gametogenesis and gonadogenesis in sturgeons. 1. On criteria for comparative assessment of juvenile gonadal development in the example of the Russian sturgeon, Acipenser gueldenstaedtii. J Ichthyol 1991; 31:101–114.
23. Pelissero C, Le Menn F, Kaushick S. Estrogenic effect of dietary soya bean meal on vitellogenesis in cultured Siberian sturgeon Acipenser baeri. Gen Comp Endocrinol 1991; 83:447–457.
24. Doroshov SI, Moberg GP, Van Eenennaam JP. Observations on the reproductive cycle of cultured white sturgeon, Acipenser transmontanus. Environ Biol Fish 1997; 48:265–278.
25. Omoto N, Maebayashi M, Mitsuhashi E, Yoshitomi K, Adachi S, Yamauchi K. Histological observations of gonadal sex differentiation in the F2 hybrid sturgeon, the bester. Fisheries Sci 2001; 67:1104–1110.
26. Grandi G, Chicca M. Histological and ultrastructural investigation of early gonad development and sex differentiation in Adriatic sturgeon (Acipenser naccarii, Acipenseriformes, Chondrostei). J Morphol 2008; 269:1238–1262.
27. Alavi SMH, Rodina M, Gela D, Linhart O. Sperm biology and control of reproduction in sturgeon: (I) testicular development, sperm maturation and seminal plasma characteristics. Rev Fish Biol Fisheries 2012; 22:695–717.
28. Rzepkowska M, Ostaszewska T. Proliferating cell nuclear antigen and Vasa protein expression during gonadal development and sexual differentiation in cultured Siberian (Acipenser baerii Brandt, 1869) and Russian (Acipenser gueldenstaedtii Brandt & Ratzeburg, 1833) sturgeon. Rev Aquaculture 2013; (in press). Published online ahead of print 14 May 2013; DOI:10. 1111/raq.12027.
29. Kolman R. Jesiotry cho?w i hodowla [Sturgeon Aquaculture]. Olsztyn, Poland; IRS Press; 2006:69–75.
30. Quintero-Hunter I, Grier H, Muscato M. Enhancement of histological detail using metanil yellow as counterstain in periodic acid Schiff’s hematoxylin staining of glycol methacrylate tissue sections. Biotech Histochem 1991; 66: 169–172.
31. Gordon H, Sweets HH. A Simple Method for the Silver Impregnation of Reticulum. Am J Pathol 1936; 12:545–552.
32. Grier HJ. The germinal epithelium: its dual role in establishing male reproductive classes and understanding the basis for indeterminate egg production in female fishes. In: Creswell RL (ed.), Proceedings of the Fifty- Third Annual Gulf and Caribbean Fisheries Institute. Fort Pierce, Florida: Mississippi/Alabama Sea Grant Consortium; 2002:537–552.
33. Baroiller JF, D’cotta H. Environment and sex determination in farmed fish. Comp Biochem Physiol C Toxicol Pharmacol 2001; 130:399–409.
34. Ospina-Alvarez N, Piferrer F. Temperature-dependent sex determination in fish revisited: prevalence, a single sex ratio response pattern, and possible effects of climate change. PLoS One 2008; 3:e2837.
35. Ronyai A, Csengeri I, Varadi L. Partial substitution of animal protein with full-fat soybean meal and amino acid supplementation in the diet of Siberian sturgeon (Acipenser baerii). J Appl Ichthyol 2002; 18:682–684.
36. Pelissero C, Bennetau B, Babin P, Le Menn F, Dunogues J. The estrogenic activity of certain phytoestrogens in the Siberian sturgeon Acipenser baeri. J Steroid Biochem Mol Biol 1991; 38:293–299.
37. Latonelle K, Le Menn F, Kaushik SJ. Effects of dietary phytoestrogens in vivo and in vitro in rainbow trout and Siberian sturgeon: interests and limits of the in vitro studies of interspecies differences. Gen Comp Endocr 2002; 126:39–51.
38. Chakraborty SB, Molna?r T, Hancz C. Effects of methyltestosterone, tamoxifen, genistein and Basella alba extract on masculinization of guppy (Poecilia reticulata). J App Pharm Sci 2012; 2(12):48–52.
39. Green C, Kelly A. Effects of the estrogen mimic genistein as a dietary component on sex differentiation and ethoxyresorufin-odeethylase (EROD) activity in channel catfish (Ictalurus punctatus). Fish Physiol Biochem 2009; 35:377–384.
40. Kiparissis Y, Balch G, Metcalfe T, Metcalfe C. Effects of the isoflavones genistein and equol on the gonadal development of Japanese medaka (Oryzias latipes). Environ Health Perspect 2003; 111:1158–1163.
41. Adlercreutz H, Goldin BR, Gorbach SL, Hockerstedt KAV, Watanabe S, Ha?ma?la?inen EK, Markkanen MH, Ma?kelaTH, Wa?ha?laKT, Hase TA, Fotsis T. Soybean phytestrogen intake and cancer risk. J. Nutr 1995; 125:757–770.
42. Colombo RE, Garvey JE, Jackson ND Brooks R, Herzog DP, Hrabik RA, Spier TW. Harvest of Mississippi River sturgeon drives abundance and reproductive success: a harbinger of collapseJ Appl Ichthyol 2007; 23: 444–451.
43. Hurvitz A, Jackson K, Degani G, Levavi-Sivan B. Use of endoscopy for gender and ovarian stage determinations in Russian sturgeon (Acipenser gueldenstaedtii) grown in aquaculture. Aquaculture 2007; 270:158–166.
44. Yoshizaki G, Ichikawa M, Hayashi M, Iwasaki Y, Miwa M, Shikina S, Okutsu T. Sexual plasticity of ovarian germ cells in rainbow trout. Development 2010; 137:1227–1230.[/user]

Похожие статьи:

Гистологическое исследование дифференцировки гонад второго поколения бестера

Добавить комментарий

Ваш адрес email не будет опубликован. Обязательные поля помечены *

÷ два = один