Растворенные азотсодержащие вещества и фосфор определяли в воде. Общий аммонийный азот (TAN), нитрат-азот (NO₃^—N) и ортофосфаты (PO₄^3-) определяли ежедневно с t0 по t140 и регулярно (каждые три дня) с t141 по t428. Применяли тест HACH (R) (№8038 NH₃^—-N, №8507 NO₂^—-N, №8039 NO₃^—-N; №8178 PO₄^3-). Тесты применимы для морской воды и обладают высокой точностью. Изначально, тестовый набор проверяли согласно стандартным процедурам (Hansen and Koroleff, 1999). В ходе эксперимента с дня t668 по t690 общий аммонийный азот (TAN) измеряли по методу индофенола синего (Hansen and Koroleff, 1999).

Все измерения концентраций проводили с использованием спектрофотометра (Hach®, модель DR/2010). Пробу в спектрофотометре заправляли в 25 мл, 2.5 см ячейку из кварцевого стекла.

2.7.1. Пробы воды

В таблице 9 приведены точки взятия проб в RAS в различные периоды экспериментов.

Во избежание присутствия взвеси в образцах воды, во все точки взятия проб, за исключением дополнительного биофильтра, устанавливали специальную трубу с шаровым краном (рисунок 15). Труба в тройнике имела диаметр 20 мм и позволяла забрать воду по ходу водного потока.

Таблица 9. Точки взятия проб и анализ питательных веществ в различные периоды эксперимента. Отмеченные точки – выполнены

Для каждой пробы нужно 25 мл воды. Образцы воды брали перед кормлением в одно и то же время. В каждом случае сосуд ополаскивали водой из места взятия пробы. После измерения, все сосуды, инструменты и температуру дважды промывали чистой водой.

Стеклянную емкость для спектрофотометра очищали технической соляной кислотой (30%) и промывали чистой водой. Образцы набирали в 500 мл химический стакан. Спустя 30 минут осаждения, измерительным цилиндром отмеряли 25 мл образца и переливали в реакционную бутылочку из натриево-кальциевого стекла с широким горлышком для окончательного анализа питательных веществ. Для измерений в дни t668-t690 образцы воды забирали в 1000 мл лабораторные бутылки. Образцы воды фильтровали вакуум-фильтра Witt через GF-F-фильтр диаметром 47 мм (стекло-микроволоконный фильтр, Whatman®). Для определения TAN, образцы воды фильтровали под давлением с помощью шприца 50 мм и нитрат-целлюлозного фильтра диаметром 25 мм и порами 0.45 мкм (Sartorius®).

2.7.2. Калибровка аналитических методов

Калибровка в контексте спектрофотометрического анализа предполагает сравнение абсорбции образца после химической реакции с абсорбцией стандарта (т.е. искусственного образца с известной концентрацией), который обрабатывали точно таким же образцом (Hansen and Koroleff, 1999).

В этой работе процедуру калибровки выполняли при каждом определении питательных веществ, перед началом измерений, указанных в таблице 8.

2.7.3. Определение концентрации общего аммонийного азота (TAN)

2.7.3.1. Методы определения

Общий аммонийный азот (TAN) с t0 по t428 проводили по методу Несслера (Hach® method 8038). Этапы были следующие:

— Вначале к образцу добавляли минеральный стабилизатор для комплексообразования с ионами жесткости (Mg2+ и Ca2+), эквивалентный 1 мл на 1 пробу.

— Затем к образцу подливают поливиниловый спирт (3 капли) для формирования окрашенного продукта реактива Несслера с ионами аммония.

— Наконец, добавляют реагент Несслера (1мл).

— Бутылочку аккуратно переворачивают один раз для размешивания реагентов.

— Время реакции – 5 минут.

— Образец заливают в кювету спектрофотометра и ставят под красный свет с длиной волны 424 нм.

— Желтая окраска формируется пропорционально концентрации аммония в воде.

В периоде от t668 по t690 использовали метод с индофенолом синим (Hansen and Koroleff, 1999). Согласно ему, измеряли совокупность ионов NH4+ и NH3. Аммиак умеренно реагирует с щелочным раствором гипохлорита с формированием монохлорамина, который в присутствии фенола, катализирующего количества нитропруссида ионов и избытка гипохлорита, дает индофенол синий (Hansen and Koroleff, 1999). Интенсивность синего окрашивания в образце прямо пропорциональна концентрации TAN. Абсорбцию синего комплекса измеряли, используя длину волны 630 нм. Для ручного метода, следующие реагенты готовили согласно (Hansen and Koroleff, 1999). Реагент гипохлорита и цитратный буфер готовили с использованием одного упрощенного шага (Nolting, 2000).

Феноловый реагент: 800 г фенола (C6H5OH) растворяли в 300 мл этанола. Добавляли 600 мл чистой воды. 600 мл нитропруссид дигидрат натрия [Na2Fe(CN)5NO . 2H2O)] растворяли в 100 мл чистой воды. Раствор хранили в стеклянной янтарной бутылке при <8°C.

Гипохлорит реагент: 3.6 г гидроксида натрия (NaOH) растворяли в чистой воде до 100 мл. 0.5 г соли дихлор-с-триазин-2,4,6-(1Н,3Н,5Н)-триамин натрия (DTT) растворяли в приготовленном растворе NaOH. Полученный раствор хранили в стеклянной янтарной бутылке при <8°C.

Цитрат буфер: 240 г дигидрата цитрата натрия (C6H5Na3O7 . 2H2O) и 20 г ЭДТА (соль натрия) растворяли в 600 мл чистой воды. Добавляли 10 мл 1.0М раствор NaOH. Полученный раствор кипятили вплоть до объема менее 0.5 л, охлаждали, доводили до 500 мл и хранили в полиэтиленовой бутылке при комнатной температуре.

Протокол методики включал:

— вносили 1 мл фенолового реагента.

— затем добавляли 0.5 мл цитратного буфера.

— наконец, добавляли 1 мл гипохлорита.

— время реакции составляло минимум 12 часов и максимум 24 часа.

— образцы хранили в темноте при комнатной температуре 20°C.

— на следующий день считывали пробу с длиной волны 630 нм.

— синяя окраска формировалась пропорционально количеству аммония в образце.

2.7.3.2. Калибровка методов измерения

Калибровку метода Несслера проводили в экспериментах с t0 по t140 и с t141 по t428. Калибровку метода с индофенолом синим проводили с t668 по t690.

Влияние солености учитывали и калибровали. Калибровка включала приготовление стандартного раствора, согласно Hansen and Koroleff (1999). 53.5 г высушенного (100°C) хлорида аммония (NH4Cl) растворяли в 100 мл чистой воды. В качестве консерванта добавляли каплю хлороформа. Раствор, содержащий 10 ммоль/л (18.04 мг/л) NH4+, хранили в стеклянной бутылке при <8°C. Морскую воду готовили с той же соленостью, что и культуральной воды. Стандартный раствор поэтапно растворяли в морской воде и смешивали реагенты, согласно процедуре 2.7.3.1. Мутность (абсорбцию), обусловленную реагентами, также измеряли. Наконец, рассчитывали регрессию между абсорбцией и концентрацией. Значения абсорбции можно перевести в значения концентрации, следуя уравнению регрессии. Точки калибровки и линия регрессии представлены на рисунках 16 и 17.

Для метода с индофенолом синим в течение t668-t690 использовали линейную коррекцию солености (Hansen and Koroleff, 1999). Концентрацию TAN рассчитывали с помощью уравнения (4):

TAN = [1+0.0073 * (PSU * d-1)] * 0.319 * (A-0.048) * d

TAN – мг/л; линейная коррекция солености — [1+0.0073*(PSU*d-1)]; фактор калибровки – 0.319; холостой реагент – 0.048; фактор растворения – d

2.7.4. Определение концентрации нитрит-азота (NO₂^—N)

2.7.4.1. Методы определения

Концентрацию нитрит-иона (NO₂^—N) определяли с использованием метода Hach® 8507 с порошковыми подушечками. В этом методе нитрит присутствует в образце и реагирует с сульфаниловой кислотой и формируется промежуточная соль диазония. Это вещество взаимодействует с хроматогенной кислотой и появляется фиолетовое окрашивание, интенсивность которого прямо пропорционально концентрации нитрита.

Измерение проводили поэтапно:

— Содержимое подушечки аккуратно добавляли в реакционную бутылочку;

— Бутылочку трясут для растворения порошка;

— Время реакции 15 минут;

— Образец наливают в емкость для спектрофотометра и считывают с длиной волны 507 нм.

2.7.4.2. Калибровка методов измерения

Калибровку метода с диазосоединением также проводили для каждого периода измерений. Согласно Hansen и Koroleff (1999), готовили стандартный раствор нитрита. Сначала высушивали NaNO2 при 100°C в течение 1 часа. Растворяли 0.69 граммов в 1 литре чистой воды и хранили охлажденным в холодильнике (<8°C). Раствор содержал 10 ммоль/л нитрита. Готовили морскую воду с заданной соленостью. Перед началом поэтапного разбавления и измерения абсорбции, стандартный раствор разводили на 100, т.е. 1 мл раствор на 99 мл морской воды. Мутность (абсорбцию), обусловленную реагентами, также измеряли. Наконец, рассчитывали регрессию абсорбции от концентрации. Значения полученной абсорбции можно перевести в концентрацию по уравнению регрессии. Калибровочный график регрессии в экспериментах t0-t140 и t141-t428 представлен на рисунках 18 и 19, соответственно.

В эксперименте в дни t668-t690 калибровочный фактор и холостой реагент рассчитывали, усредняя три регрессии для солености 10, 20 и 30 psu. Концентрацию NO₂^—N определяли по уравнению (5):

NO₂^—N = 0.177*(A-0.021)*d

NO₂^—N – мг/л, фактор калибровки – 0.177, холостой реагент – 0.021, фактор разведения – d.

2^—N в воде t0-t140″ width=»400″ height=»292″ /> Рисунок 18. Калибровочная регрессия (p<0.05) для определения концентрации NO₂^—N в воде t0-t140

2^—N в воде t141-t428″ width=»400″ height=»289″ /> Рисунок 19. Калибровочная регрессия (p<0.05) для определения концентрации NO₂^—N в воде t141-t428

2.7.5. Определение концентрации NO₃^—N

2.7.5.1. Метод определения

Концентрацию растворенного нитрат-азота (NO₃^—N) определяли с помощью метода кадмий редукции Hach® 8039. Порошковый кадмий переводит нитрат в нитрит. Ионы нитрита реагируют в кислой среде с сульфаниламидом, формируется промежуточная соль диазониума. Эта соль соединяется с гентизиновой кислотой и формируется продукт янтарного цвета. Интенсивность окраски раствора прямо пропорционально коррелирует с концентрацией нитрата в растворе. Определение концентрации нитрата проводили следующим образом:

— в реакционную емкость аккуратно добавляем порошок реагента.

— встряхиваем бутылочку в течение 1 минуты для растворения порошка.

— время реакции 5 минут.

— образец помещали в кювету спектрофотометра под длину волны 500 нм.

2.7.5.2. Калибровка метода

Для приготовления стандартного раствора растворяли 1.011 грамма сухого KNO3 и доводили до 1 литра чистой водой. Раствор содержал 10 ммоль/л нитрата и был стабилен (Hansen and Koroleff, 1999).

Стандартный раствор поэтапно разбавляли и измеряли абсорбцию. Наконец, строили график регрессии абсорбции к концентрации вещества. Используя управление регрессии, можно перевести значения абсорбции в концентрацию. Калибровочный график и регрессия показаны на рисунках 20 и 21.

В эксперименте за период t668 по t690 калибровочный фактор определяли, рассматривая корреляцию калибровочных факторов, рассчитанных для четырех различных уровней солености (0, 10, 20 и 30 psu). Холостой реагент определяли с использованием чистой воды, так как концентрация нитрата в искусственной морской воде включает слишком много фонового шума. Затем концентрацию нитрат-азота рассчитывали по уравнению (6):

NO₃^—-N = [(0.3424 * PSU) + 30.654] * (A-0.021) * d

NO₃^—-N – мг/л, калибровочный фактор — [(0.3424 * PSU) + 30.654], холостой реагент – 0.021, фактор разведения – d.

2.7.6. Определение концентрации фосфора (PO4-3)

2.7.6.1. Метод определения

Все методы определения органического фосфора в морской воде базируются на реакции ионов с кислым молибдатом до образования фосфомолибдата гетерополикислоты, которая восстанавливается до ярко окрашенного синего соединения (Hansen andKoroleff, 1999). На этом принципе работает метод Hach® 8178. Определение концентрации фосфора проводили следующим образом:

— 1 мл молибдата вносили в реакционную бутылочку.

— затем добавляли 1 мл раствора аминокислоты

— бутылочку аккуратно переворачивали несколько раз до смешивания реагентов.

— экспозиция 10 минут.

— раствор наливали в кювету к спектрофотометру под длиной волны 530 нм.

2.7.6.2. Калибровка метода измерения

Стандартный фосфатный раствор и серную кислоту готовили согласно (Hansen and Koroleff, 1999). Концентрированную серную кислоту (ρ=1.84 г/мл) вносили в чистую воду в соотношении 1:3 до общего объема 1 литр. После охлаждения объем проверяли. Потери объема восполняли чистой водой до 1 литра. Раствор хранили в полиэтиленовой бутылке. Дигидроортофосфат калия (KH2PO4, относительная молекулярная масса 136.09) высушивали при 110°C, а затем помещали в эксикатор. Точную массу 136.09 мг растворяли в чистой воде, затем добавляли 0.2 мл серной кислоты (приготовленной) и доводили объем до 100 мл. Раствор, содержащий 10 ммоль/л фосфата, хранили в стеклянной бутылке.

Стандартный раствор фосфата поэтапно разводили и измеряли абсорбцию. Мутность (абсорбция), обусловленную реагентами, также измеряли. Наконец, рассчитывали регрессию абсорбции к концентрации. Значения абсорбции можно перевести в концентрацию, используя уравнение регрессии. Калибровочный график и регрессия представлены на рисунке 22 и 23.

Для экспериментов t668-t690 калибровочный фактор и холостой реагент рассчитывали усредняя четыре регрессии для соленостей 0, 10, 20 и 30 psu. Концентрацию фосфора определяли по уравнению (7):

PO4-3 = 21.16 * (A-0.013) * d

PO4-3 — мг/л, калибровочный фактор — 21.16, холостой реагент — 0.013, фактор разведения – d.