Молекулярные методы диагностики теоретически более чувствительные и быстро выполнимые, чем культивирование, серологические и гистологические методы, традиционно используемые для идентификации патогенных организмов рыб. В течение последних 15 лет молекулярная диагностика заболеваний значительно продвинулась в области рыбоводства. К числу её методов относятся полимеразная цепная реакция (ПЦР), рестрикционный анализ, гибридизация образца, in situ гибридизация и микрочипирование. Так как озвученные методы позволяют обнаруживать патогенные организмы у рыб-носителей, можно предотвратить вспышку заболевания. Это снижает нагрузку от антибактериальной терапии и исключает развитие стойких штаммов бактерий. Использование молекулярных методов диагностики в рыбоводческой практике отчасти ограничивается доступностью литературы в данной области, поэтому в данной главе приводятся общие сведения из данной области.

1. Полимеразная цепная реакция (ПЦР)

Полимеразная цепная реакция позволяет увеличить количество фрагментов ДНК-мишени, определяемых при помощи двух праймеров, ДНК которых, в свою очередь, синтезируется с помощью термостабильных ДНК полимераз. Обычно наблюдается возрастание фрагментов ДНК в миллион раз, и полученные продукты ПЦР можно определить путем электрофореза в геле. Области амплификации насчитывают 150-3000 пар оснований. На чувствительность и специфичность праймера влияет его строение. Отсюда, праймеры должны быть достаточно длинными для выдерживания высокой температуры отжига и снижения возможности отжига неспецифичных праймеров. Тем не менее, слишком длинные праймеры способствуют неспецифическому отжигу, даже, когда участки ДНК полностью комплементарны последовательности праймера. Реакция включает ДНК-матрицу в различных формах, от тканевого лизата до очищенной ДНК, праймеры, полимеразы для ускорения сборки копий ДНК, нуклеотиды для формирования новых копий. С каждым этапом реакции в температурном цикле ДНК-матрица денатурируется, происходит отжиг праймеров к комплементарным областям, и полимеразы катализируют приращение нуклеотидов к концу каждого праймера. Таким образом, собираются копии фрагментов ДНК. Теоретически, в каждом цикле приращение продуктов реакции должно происходить в геометрической прогрессии. Метод полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР) используется для определения специфической мРНК и уровня экспрессии генов. Для количественного анализа уровня мРНК в очень небольших образцах полимеразная цепная реакция с обратной транскрипцией используется при выполнении и сравнении Нозерн-блот анализа и метода защиты от РНКазы. Фактически, ПЦР достаточно чувствительна для количественной оценки РНК в единичной клетке. За последние несколько лет развитие химической индустрии и инструментария позволили определять продукты ПЦР в реальном времени. Это привело к широкому внедрению ОТ-ПЦР в качестве метода оценки количественных изменений экспрессии генов в реальном времени. Более того, при оценки экспрессии генов полимеразную цепную реакцию с обратной транскрипцией предпочитают использовать для проверки результатов, полученных при выполнении других анализов. Чувствительность и избирательность, достигаемые при качественном выполнении ОТ-ПЦР делают его идеальным инструментом для надзора и мониторинга скрытых инфекций. Как и в случае с эукариотами, прокариотические гены рРНК содержат высоко консервативные последовательности. Теоретически, рассмотрение консервативных фрагментов генов, кодирующих РНК, после амплификации, с последующей идентификацией более вариабельных генных или бессмысленных последовательностей, позволит определять бактерии, которых сложно или невозможно распознать при культивировании.

2. Мультиплексная полимеразная цепная реакция, мультипраймерная полимеразная цепная реакция ПЦР

Новые разработки в области ПЦР позволили определять сразу несколько патогенных организмов, что улучшило и удешевило метод. В мультипраймерном ПЦР анализе амплифицируется более одной целевой последовательности, поэтому он включает несколько пар праймеров. Данный метод поможет сэкономить время без ущерба чувствительности. Со времени своего открытия мультипраймерный анализ внедрился во многие дисциплины изучения нуклеиновых кислот, включая анализ генных делеций, количественный анализ и обнаружение РНК. В области диагностики инфекционных заболеваний, техника показала свою ценность в идентификации вирусов, бактерий, грибов и паразитов.

3. Маркирование и обнаружение нуклеиновых кислот

Для анализа нуклеиновых кислот существуют различные системы маркирования и обнаружения. Хотя используются радиоизотопы, они опасны для исследователя, поэтому начинают развиваться и другие методы. Среди них можно отметить маркирование гаптены, например, биотин или дигоксигенин, и обнаружение с помощью антител, связанных флуоресцентной, хемилюминесцентной или колориметрической метками.

4. Рестрикционный анализ

Ферменты рестрикции (эндонуклеазы рестрикции) расщепляют ДНК в очень специфической форме. Ферменты рестрикции типа 2, наиболее распространенные в ЛНК анализе и генетической инженерии, имеют уникальную нуклеотидную последовательность, которая позволяет им разрезать ДНК. Некоторые ферменты рестрикции расщепляют ДНК только по определенной последовательности, обычно составляющей 6 пар палиндромной цепи, другие расщепляют 4 или даже 8 пар последовательностей. Чаще всего эндонуклеазы рестрикции используются для создания «отпечатков пальцев» конкретной молекулы ДНК. Так как фермент имеет специфическое строение, он разрезает ДНК на отдельные фрагменты, которые можно разделить с помощью электрофореза в геле. Модель ДНК фрагментов создает «отпечатки пальцев» ДНК, и каждая молекула ДНК имеет свои отпечатки. Другие ферменты рестрикции могут использоваться для дальнейшей характеристики конкретной ДНК молекулы. Местонахождение зон расщепления после воздействия ферментов рестрикции служит основанием для составления карты. Эти карты нужны для идентификации и описания частной ДНК плазмиды или её области. Ферменты рестрикции определяют специфические короткие последовательности ДНК и расщепляют молекулу по конкретным местам. Изменения в одиночном нуклеотиде приводят к появлению, либо потере места разрезания, поэтому они влияют на количество получаемых фрагментов. Этот полиморфизм длин рестрикционных фрагментов (RFLP) можно увидеть с помощью электрофореза ДНК в геле. Различия RFLP профилей явилось революцией в криминалистических исследованиях, стало мощным инструментом в идентификации родителей, популяционной генетике и диагностике различных заболеваний.

5. Полиморфизм длин рестрикционных фрагментов (RFLP)

RFLP является методом, в котором организмы дифференцируются на основе различий модели, полученной в результате расщепления ДНК. Если у двух организмов имеются различия по расстоянию между местами расщепления, длина образующихся фрагментов ДНК после воздействия эндонуклеаз рестрикции также будет различаться. Схожесть моделей может использоваться для установления видовой принадлежности (или даже различения породы и штамма). Выделение достаточного количества ДНК для проведения RFLP требует много времени и усилий. Тем не менее, для этих цели можно использовать ПЦР, которая в течение 2-3 часов произведет достаточное количество ДНК.

6. Полиморфизм длин амплифицированных фрагментов (AFLP)

Оперативный, базирующийся на ПЦР, метод AFLP может использоваться для типирования прокариот и эукариот. Он основывается на селективной ПЦР амплификации геномных рестрикционных фрагментов целого генома и является быстрым, воспроизводимым и высоко избирательным. Избранные маркеры амплифицируются с помощью ПЦР, которая делает AFLP легким и быстрым инструментом для идентификации штаммов, пород и сортов в растениеводстве, микробиологии и животноводстве. AFLP анализ относится к категории методов избирательной амплификации рестрикционных фрагментов, который основан на лигировании адаптеров геномными рестрикционными фрагментами и последующей ПЦР амплификации с адаптер-специфичными праймерами. Для AFLP анализа необходимо небольшое количество очищенной геномной ДНК; она расщепляется двумя ферментам рестрикции, один из которых обладает средней частотой расщепления (например, EcoRI), а второй – высокой частотой расщепления (например. MseI или TaqI). Двухспиральные олигонуклеотидные адаптеры создаются таким образом, чтобы изначальное место рестрикции не восстанавливалось после лигирования. Это позволяет синхронизировать рестрикцию и лигирование, пока повторно лигированные фрагменты снова расщепляются. Затем аликвотную пробу подвергают двум последовательным ПЦР амплификациям в жестких условиях со специфичным к адаптеру праймером, который на 3’-конце имеет удлинение из одного или трех нуклеотидов, сталкивающееся с неизвестным хромосомным рестрикционным фрагментом. Альтернативная процедура AFLP типирования основана на одном ферменте с единичным адаптером и анализа с помощью электрофореза в агарозном геле. Главное улучшение технологии переходе от радиоактивных меток к флуоресцентным праймерам для определения фрагментов в автоматической последовательности. Кроме того, показано, что для мелких геномов бактерий и грибов достаточно единичной ПЦР амплификации с 1-2 селективными нуклеотидами на обоих праймерах.

7. ПЦР со случайной амплификацией полиморфной ДНК (RAPD)

Технически сложный метод RAPD был применен для изучения гриба, вызывающего чуму рака Astacus astaci. RAPD использует единичный праймер с мягких условиях ПЦР. Случайное связывание праймеров приводит к образованию фрагментов различного размера в образцах с неидентичными ДНК. Применение метода позволяет группировать различные изоляты грибов и, таким образом, обеспечивать почву для эпидемиологических исследований (Lilley et al., 1997; Oidtmann et al., 1999). Во время серьезных потерь дикой и хозяйственной рыбы в Азии RAPD помог идентифицировать патогенные виды Aphanomyces (Lilley et al., 1997). Другие патогенные организмы также могут исследоваться с помощью данного метода, однако проблемы с воспроизводимостью результатов и риском загрязнения ограничивают его использование в качестве самостоятельного. Тем не менее, RAPD пригоден на первом этапе разработки специфических праймеров или проб, и таким образом применяется в диагностике бактерий.

8. In situ гибридизация

ПЦР в условиях in situ стала мощным инструментом в исследовании и клинической практике. Этот метод привел к лучшему пониманию патогенеза инфекционных и неопластических заболеваний, и улучшил их диагностику. In situ ОТ-ПЦР, благодаря высокочувствительному обнаружению минимальной экспрессии генов в клетке, позволило изучать образцы более детально. Пригодность данного метода ПЦР in situ ограничивается его низкой чувствительностью, плохой воспроизводимостью и высоким фоном. Более того, многие методы, используемые для визуализации результатов ПЦР амплификации в клетке и тканях, включают радиоактивные метки, что делает технологию очень трудоемкой и затратной. Исследователи создали метод специфичного флуоресцентного обнаружения экспрессии генов в in situ ОТ-ПЦР. Он позволил клиницистам определять низкий уровень экспрессии генов в тканях с очень незначительным фоном интерференции, в то время как другие существенные недостатки все ещё устраняются. Потенциальной областью внедрения in situ ОТ-ПЦР выступает диагностика вирусов и прочих инфекционных агентов в специфической клеточной культуре, описание опухолевых клеток в тканях, диагностика генетических мутаций в наследственном заболевании и определение экспрессии генов в тканях. В ходе флуоресцентной in situ гибридизации, FISH, осуществляется маркирование клеток и хромосом, согласно последовательностям нуклеиновых кислот в их составе. В микробиологии обычно маркируются РНК или ДНК рибосом и мишенью обычно являются целые клетки. В ходе этого процесса берутся флуоресцентные метки, РНК или ДНК зонды, которые имеют длину около 20 нуклеотидов. Зонды инкубируются в присутствии клеток в условиях, которые необходимы для осуществления специфичной гибридизации пробы с целевой нуклеиновой кислотой. Тип клеток, которые содержат рибосомы с комплементарными РНК последовательностями, маркируются при связывании in situ с флуоресцентным зондом. Меченные клетки можно увидеть с помощью проточной цитометрической или флуоресцентной микроскопии.

9. ДНК микрочипы

Существует ряд вариантов использования ДНК микрочипов для определения уникальных ДНК (или РНК) последовательностей. Один из методов предполагает маркирование всех ДНК последовательностей в анализируемой пробе. Образец ДНК, который подвергся гибридизации микрочипами имеет специфические флуоресцирующие места, обнаруживаемые при помощи специального оборудования и компьютерных программ. Часто бывает более практично использовать конкурентную гибридизацию, при которой анализируемый образец конкурирует за гибридизацию к привязанному к чипу олигонуклеотиду с флуоресцирующим конкурентным олигонуклеотидом. Когда анализируемая ДНК идеально комплементарна к привязанному олигонуклеотиду, она гибридизируется с чипом. В противном случае, конкурентный флуоресцирующий олигонуклеотид смещает ДНК образец и сам гибридизируется с олигонуклеотидом чипа. Детектор и компьютерная программа может анализировать флуоресцентные ряды по присутствию или отсутствию специфичной видовой ДНК последовательности. По сравнению с традиционной гибридизацией нуклеиновых кислот с мембранами, микрочипирование обладает дополнительными преимуществами, в частности, высокой плотностью сигнала, высокой чувствительностью, низкой стоимостью, возможностью автоматизации процесса и низким уровнем фона. Микрочипы могут стать наилучшим инструментом для проведения диагностики в больших масштабах. Они позволяют рассматривать образец сразу по многим последовательностям. Реализация данного метода значительно упрощается, так как большинство генетических последовательностей патогенных микроорганизмов доступны в генетическом банке “GenBank”. Это дает возможность создавать и вводить в микрочип олигонуклеотидные пробы, комплементарные всем патогенам. Таким образом, при использовании одного микрочипа можно обнаружить сразу несколько микробов. Технология микрочипирования не требует высокой консервативности генетической последовательности, потому что все разнообразие последовательностей в различных популяциях общей функциональной группы могут нанизываться на матрицу и использоваться в качестве пробы для мониторинга заразных заболеваний рыб, в частности, в фазу отсутствия симптомов. Большое количество проб на матрице может сказать о том, какой ген присутствует или экспрессируется в образце. Данный тип матрицы особенно подходит для изучения патогенных организмов, когда присутствие определенных генов и их продуктов может подтверждать или опровергать их контагиозность. Стоимость организации микрочипирования ДНК большая. Однако с покупкой необходимого оборудования и микрочипов затраты на одну пробу очень низкие. Более того, весь анализ не занимает много времени. В будущем, технология микрочипов будет активно применяться в диагностике заболеваний рыб, особенно на асимптоматической фазе.

10. Цикл опосредованно изотермической амплификации (LAMP)

Цикл опосредованно изотермической амплификации (LAMP) является новым методом амплификации нуклеиновых кислот, при котором ДНК амплифицируется с высокой специфичностью, эффективностью и скоростью в условиях постоянной температуры (Natomi et al, 2000). При совмещении с обратной транскрипцией LAMP может с высокой эффективностью амплифицировать РНК последовательности. LAMP основан на автоматическом цикле синтеза ДНК цепи со смещением при использовании ДНК полимераз с высокой активностью смещения и четырех специально созданных праймеров. Четыре праймера, обозначаемых как внутренние и внешние, определяют шесть отдельных последовательностей ДНК-мишени, что улучшает специфичность реакции. Реакция протекает в изотермических условиях, так как денатурация цепей происходит за счет их смещения.

Реакция LAMP: На начальном этапе LAMP реакции участвуют все четыре праймера, однако, в позднем цикле реакции для смещения цепи ДНК во время синтеза вовлечены только внутренние праймеры. Сама реакция инициируется внутренними праймерами, содержащими смысловые и бессмысленные последовательности ДНК-мишени. Высвобождение одноцепочечной ДНК происходит с помощью внешнего праймера. Затем получившаяся цепь используется в качестве шаблона для синтеза ДНК, который запускается вторым внутренним и внешним праймерами, гибридизирующими с другого конца мишени. Данный процесс приводит к формированию цепи ДНК с петлей. На последующих этапах LAMP цикла, один внутренний праймер гибридизирует петлю продукта и запускает смещение цепи синтезируемой ДНК, что вызывает образование нового изгиба ДНК с петлей. Цикл продолжается примерно в течение 1 часа и приводит к образованию примерно 10⁹ копий ДНК мишени. Конечный продукт реакции представляет собой цепи ДНК с петлями различной длины, состоящие из нескольких перевернутых повторяющихся последовательностей оригинального ДНК шаблона (структура похожа на цветную капусту).

Визуализация продуктов амплификации. Для визуализации конечного продукта LAMP реакции могут использоваться несколько методов. Чаще всего применяется метод визуализации с помощью электрофореза в агарозном геле. Агарозный гель окрашивают красителями, например, бромистый этидий или SYBR Green I. Так как конечный продукт состоит цепей различной длины с многочисленными петлями ДНК, электрофорез в агарозном геле определяет продукты с минимальным количеством копий ДНК мишени в загрузочной лунке, которые выглядят как мазок на верхушке и петли в основании геля. LAMP реакция позволяет синтезировать чрезвычайно большое количество ДНК. Добавление красителя SYBR Green I в реакционную пробирку дает возможность визуализировать продукты с помощью прибора для УФ просвечивания флуоресцирующих в свете или поглощающих свет объектов. Данный метод пригоден для полевых наблюдений, где лимитирующим фактором является электрофорез в геле. Другой способ предусматривает накопление большого количества побочных продуктов реакции. В LAMP реакции образуется большое количество побочных продуктов, ионов пирофосфата, от которых в реакционной смеси получается белый осадок пирофосфата магния. Поэтому путем определения присутствия или отсутствия белого осадка можно узнать, амплифицировалась ли ДНК. Так как в ходе реакции происходит возрастание плотности раствора, для определения её окончания можно использовать колориметрию.

Преимущество LAMP заключается в высокой эффективности амплификации ДНК в условиях постоянной температуры. Предел определения в LAMP составляет несколько копий и сопоставим с ПЦР. На чистоту результата не оказывает существенного влияния присутствие нецелевых цепей ДНК. LAMP является простым, легким и высокоселективным методом. Он высокоспецифичен для целевой последовательности, потому что использует четыре праймера, нацеленных на многие звенья одной последовательности. Для выполнения анализа (после приготовления соответствующих праймеров) необходима лишь лабораторная водяная баня или температурный блок для реакции. В совокупности с обратной транскрипцией метод подходит для амплификации РНК.

Недостатки LAMP. Так как амплифицированного продукта очень много, он легко загрязняется в последующих циклах амплификации. Мультиплексная ПЦР нельзя использовать после данного метода.

Преимущества молекулярных методов диагностики
Помимо высокой чувствительности и быстрой диагностики, главным преимуществом молекулярных методов исследования является определение не культивируемых агентов. ДНК амплификация позволяет идентифицировать патогенный микроорганизм в очень малых количествах, в очень малом объеме пробы. Появляется возможность диагностики инфекций в латентной фазе развития, идентификации хозяина инфекции. Данные методы позволяют проводить различия патогенных микроорганизмов со схожими антигенными структурами.

Основным недостатком является дороговизна оборудования и реактивов. При проведении молекулярного анализа нельзя определить не известный ранее организм.
——

---

Статья подверглась 1 проверке читателем (23.01.2014)

---

[user]по материалам: Arun Sudhagar S, Ezhil Nilavan S, Linga Prabu D, Rathi Bhuvaneswari G, Chandrasekar S and Rajesh kumar R. Diagnostic Tools Used in Fish Disease Diagnosis. Central Institute of Fisheries Education, Mumbai
aquafind.com/articles/FishDiseaseDiagnosis.php

K Riji John & Rosalind George, 2004, Fin Fish & Shell Fish Diseases (Practical Manual). Fisheries College & Research Institute, Thoothukudi.
S Felix, Riji John, Prince Jeyaseelan & V Sundararaj, 2001, National Traning Course On Fish Disease Diagnosis & Health Management, Fisheries College & Research Institute, Thoothukudi.
K M Shankar & C V Mohan, 2002, Fish And Shellfish Health Management, College Of Fisheries, Mangalore.
Ilhan Altinok & Ilknur Kurt, 2004, Molecular Diagnosis Of Fish Diseases: A Review, Turkish Journal Of Fisheries And Aquatic Sciences 3: 131-138
National Standard Methods, Center For Infection, Wales.
Erlich, H.A. PCR Technology Principles And Applications For DNA Amplification. Stockton Press, New York, 1989.
PCR Technology: Current Innovations, 2nd Edition. Edited By Thomas Weissensteiner Et Al.
Edawards K., Logan J., Saunders N. (Eds.). 2004. Real-Time PCR: An Essential Guide. Horizon Bioscience, Norfolk, UK, P. 346.
Durand S.V., Lightner D.V. 2002. Quantitative Real Time PCR For The Measurement Of White Spot Syndrome Virus In Shrimp. J. Fish Dis. 25, 381-389.
La Fauce K.A., Layton R., Owens L. 2007. Taqman Real-Time PCR For Detection Of Hepatopancreatic Parvovirus From Australia. J. Virol. Methods, 140, (1-2), 10-16.
Mouillesseaux K.P., Klimpel K.R., Dhar A.K. 2003. Improvement In The Specificity And Sensitivity Of Detection For The Taura Syndrome Virus And Yellow Head Virus Of Penaeid Shrimp By Increasing The Amplicon Size In SYBR Green Real-Time RT-PCR. J. Virol. Methods, 111 (2), 121-127.
Rajendran K.V., Jeff A. Cowley, Russell J. Mcculloch, Peter J. Walker. 2006. A Taqman Real-Time RT-PCR For Quantifying Mourilyan Virus Infection Levels In Penaeid Shrimp Tissues. J. Virol. Methods 137, 265-271.
Tang K.F., Wang J., Lightner D.V. 2004. Quantification Of Taura Syndrome Virus By Real-Time RT-PCR With A Taqman Assay. J. Viro. Methods 11, 109-114.
[/user]