Геном морской вши Caligus rogercresseyi открыл возможность применения стратегии обратной вакцинологии для выявления антигенов, потенциально влияющих на развитие вшей, и их использования в борьбе с этими паразитами. Данное исследование направлено на изучение эффективности трех вакцин против морских вшей на ранней стадии инвазии с помощью оценки транскриптомной модуляции иммунизированного атлантического лосося. Таким образом, три экспериментальные группы Salmo salar (атлантический лосось) вакцинировали рекомбинантными белками: перитрофин (прототип А), катепсин (прототип В) и их смесь (прототип С), соответственно.

Зараженность морскими вшами оценивали во время стадии халимус I-II, ранних инфекционных стадий прикрепления на 7 день после заражения. Параллельно брали образцы тканей головной почки и кожи для секвенирования мРНК по технологии Illumina. Анализ относительной экспрессии генов проводился для выявления иммунных реакций, транспорта железа и стрессовых реакций, связанных с тестируемыми вакцинами на ранних стадиях заражения морскими вшами. Прототипы вакцин A, B и C снизили паразитирование на 24, 44 и 52% по сравнению с контрольной группой. Кроме того, анализ РНК-секвенирования показал зависимую от прототипа модуляцию транскриптома. Значительные различия в экспрессии наблюдались в генах, касающихся связывания ионов металлов, молекулярных процессов и образования энергии. Полученные данные свидетельствуют о балансе между воспалительной реакцией хозяина и метаболическим процессом у вакцинированных рыб, повышении их транскрипционной активности, что может изменить ранние взаимодействия хозяина и паразита. Данное исследование описывает молекулярные реакции, вызванные тремя прототипами вакцин на ранних стадиях инвазии, предоставляя новые знания для борьбы с морскими вшами в лососевой аквакультуре.

Интерес отрасли аквакультуры к методам профилактики заболеваний усилил направленность на разработку новых и эффективных вакцин для рыбы [1]. В настоящее время многие вакцины используются для борьбы с бактериями и вирусами [2,3,4]. Однако разработка вакцин против эктопаразитов рыб остается главной проблемой в аквакультуре. Научные данные об отношениях хозяин-паразит необходимы для разработки вакцин против эктопаразитов [5,6]. Таким образом, омические подходы могут расширить наше представление о молекулярных механизмах, участвующих в биологии паразита и взаимодействии с хозяином. Полученная информация может использаться в качестве новых целевых показателей для борьбы с паразитами [6,7]. В данном контексте разработка вакцин на основе обратной вакцинологии представляет собой ценный подход к открытию антигенов. В частности, растущие возможности биоинформационного анализа улучшают процесс отбора биомолекул, потенциально эффективных в качестве вакцин против паразитов рыб [8,9].

Два белка с антигенным потенциалом для разработки вакцины против эктопаразитов — катепсин и перитрофин [10,11]. Роль обоих белков в основных процессах развития отношений хозяин-паразит делает их хорошими потенциальными вакцинами. Катепсины беспозвоночных являются протеазами со многими физиологическими функциями [12], такими как деградация и оборот внутриклеточных белков и иммунный ответ [13,14]. Кроме того, катепсины участвуют в переваривании гемоглобина у паразитов-гематофагов, таких как клещи и анкилостомы [14,15,16]. Более того, у некоторых гематофагов, таких как морские вши, катепсины идентифицированы на всех стадиях развития и связаны с механизмами взаимодействия хозяина и патогена [17,18,19]. Аналогичным образом, перитрофины участвуют в нескольких физиологических процессах. Данные белки входят в состав перитрофического матрикса, выстилающего кишечник некоторых беспозвоночных животных [20,21]. Перитрофины участвуют в борьбе с патогенной инфекцией [22,23] и защите кишечника во время взаимодействия хозяина и патогена [24,25]. Например, перитрофин комара Anopheles gambiae принимает группы гема, полученные в результате деградации крови, предотвращая образование свободных радикалов и защищая кишечник комара от токсичности свободного гема [26,27]. Значительная функциональная роль обоих белков стимулировала оценку их антигенного потенциала для борьбы с вредителями с помощью катепсинов [11,28,29,30] и перитрофинов [10,31,32].

Для борьбы с морскими вшами испытаны различные прототипы вакцин против эктопаразитов. Например, ранее изучены антигены my32, TT-P0, транспортер хлорида калия и транспортер аминокислот [33,34,35]. Эти исследования отражают снижение зараженности паразитами у S. salar с эффективностью от 30 до 57%. Кроме того, в ответ на вакцинацию против эктопаразитов наблюдалось появление гуморальных и клеточных компонентов в организме рыбы-хозяина [36,37,38]. В частности, наблюдалась модуляция экспрессии IgM и IgT, антиоксидантного ответа и соответствующих воспалительных генов у рыб, иммунизированных и подвергшихся заражению эктопаразитами [37,39,40]. Получены сведения об использовании антигенов, связанных с модуляцией метаболизма железа в организме хозяина [41]. Недавно опубликованное нами исследование показывает, что вакцина IPath^® с хелатирующей функцией железа позволила снизить инфицирование морскими вшами более чем на 90% [41]. Полученные результаты позволили предположить, что идентифицированные антигены морских эктопаразитов вызывают гуморальный и клеточный иммунный ответ хозяина и активируют питательный иммунитет хозяина во время заражения вшами [42].

В Чили морская вошь Caligus rogercresseyi считается причиной одного из самых значительных экономических потерь для аквакультуры лосося [43,44]. Этот вид копепод питается слизью, кожей и кровью рыб, вызывая поражения, потерю веса и иммуносупрессию у рыб [42,45,46]. У C. rogercresseyi взаимодействие хозяина и паразита начинается, когда во время копеподитной стадии распознается хозяин, развивается передняя нить для прикрепления к коже рыбы [47,48]. Впоследствии морские вши начинают питаться в стадии халимус I [49], в которой отмечаются видовые различия, и сообщается о различном уровне заражения вшами среди устойчивых и подверженных заражению хозяев [50,51]. В последние годы многие исследования предоставили информацию для более полного представления о механизмах заражения C. rogercresseyi и ответных реакциях хозяина [42,52,53].

Примечательно, что геном C. rogercresseyi секвенирован и собран в псевдохромосомы [53], предоставляя важнейшую молекулярную информацию для раскрытия соответствующих генетических компонентов и биологических процессов в течение жизненного цикла C. rogercresseyi. В данном случае модуляция генов, связанных с иммунным ответом, транспортом железа и реакцией на стресс, выявлена у атлантического лосося на ранних стадиях инфекции. Наряду с этим, биоинформационные анализы выявили специфические белки, играющие важную роль на ранних стадиях развития копеподит и халимуса. На основе полученных ранее данных, цель работы заключалась в оценке трех прототипов вакцин против заражения морскими вшами атлантического лосося. Оценка вакцины проводилась посредством транскриптомного профилирования иммунизированных рыб и уровня эффективности во время раннего заражения C. rogercresseyi.

Обратная вакцинология — это стратегия, которая изменяет способ отбора антигенов для производства вакцин. Массовое описание всего генома различных организмов, а также биоинформационные инструменты, разработанные в последние годы, позволяют обнаружить множество альтернатив для антигенов вакцин [8,9]. Недавно обнародованный геном C. rogercresseyi [53] позволяет идентифицировать белки, имеющие отношение к процессу заражения морскими вшами и уклонению от иммунного ответа хозяина. Данные белки имеют значительный потенциал для испытаний в качестве антигенов для борьбы с морскими вшами на основе стратегии создания вакцины для рыб. Ранее исследовательская группа охарактеризовала гены катепсина и перитрофина с высоким уровнем экспрессии на стадиях заражения C. rogercresseyi [18,60]. Катепсины — это протеолитические ферменты, которые участвуют в механизмах иммунного уклонения и выживания паразитов [61]. У морских вшей катепсины выделяются как часть ферментной базы паразита во время взаимодействия патогена и хозяина [19,61]. Кроме того, катепсины участвуют в биологических процессах паразитов, таких как линька, внеклеточное пищеварение и эмбриогенез [62,63,64]. Также сообщалось о роли катепсинов в переваривании питательных веществ, таких как гемоглобин, полученный от хозяина, у паразитов-гематофагов [13,14]. Перитрофины — это хитин-связывающие белки, первоначально выделенные из перитрофической мембраны в кишечнике насекомых [24,25]. У насекомых перитрофины играют важную роль во взаимодействии хозяина и паразита и, предположительно, выполняют защитную роль против поглощенных токсинов, патогенов и иммунных компонентов хозяина [22,23]. Кроме того, у кровососущих насекомых, таких как малярийный комар Anopheles gambiae, перитрофины ограничивают образование свободных радикалов под действием групп гема, захваченных у хозяев [24,27]. Такие свойства катепсина и перитрофина делают их важными составляющими для борьбы с паразитами и их использовали в качестве антигенов в прототипах вакцин против паразитов млекопитающих и кур [31,65,66]. Данные белки предложили использовать для разработки вакцин против патогенов аквакультуры [67,68]. В данном исследовании описаны молекулярные профили S. salar, вакцинированных тремя прототипами вакцин с антигенами перитрофина и катепсина, во время раннего процесса инвазии C. rogercresseyi.

Поведение, физиология, приспособленность, здоровье и метаболизм хозяина зависят от заражения паразитами [69,70,71,72]. С целью предотвращения неблагоприятных последствий заражения паразитами индустрия аквакультуры применяет различные стратегии, такие как использование специальных рационов, селективное разведение, вакцины и др. [73,74,75,76,77]. Для борьбы с морскими вшами использовали функциональные рационы, включающие иммуностимулирующие компоненты, которые повышают концентрацию белков слизи и вызывают снижение уровня зараженности Lepeophtheirus salmonis [78]. Кроме того, описано снижение уровня паразитирования на разных стадиях развития с помощью прототипов вакцин [34]. Недавно белки L. salmonis, связанные с функцией средней кишки, рассмотрели как антигены, которые продемонстрировали 31 и 35% защиты лосося. Более того, химерная антигенная конструкция из различных белков-транспортеров железа морских вшей (IPath^®) показала модуляцию гомеостаза железа и генов иммунного ответа у S. salar. Вакцины IPath^® показали 95% эффективности в снижении заражения C. rogercresseyi [41,79]. В данном исследовании оценивали действие трех прототипов вакцин при заражении морскими вшами. В результате выявлено значительное снижение численности паразитов в группе рыб, вакцинированных прототипами B и C, по сравнению с контрольной группой. Кроме того, оба прототипа, включая катепсиновый антиген, имеют множество модулированных транскриптов, связанных с процессами метаболизма и производства энергии. Группа рыб, вакцинированная прототипом А, существенно не отличалась от контрольной группы. Кроме того, в этой группе рыб наблюдалось большое количество модулированных транскриптов, связанных с процессом развития и формированием анатомической структуры, что могло снизить количество энергии, которое необходимо рыбе для эффективной реакции на заражение морскими вшами, или для улучшения жизненных функций рыбы.

Кожа рыбы является первым защитным барьером против внешних стрессовых факторов [80,81]. У морских вшей фиксация, по имеющимся данным, активизирует процесс восстановления и созревания тканей для реэпителизации кожи рыб [82,83,84]. В данном исследовании транскриптомный анализ показал большое количество транскриптов, высоко регулируемых в тканях кожи рыб, вакцинированных прототипом С (комбинация перитрофина и катепсина), по сравнению с кожей рыб из группы, вакцинированной прототипом А (перитрофин). Транскрипты, выявленные у вакцинированных рыб, связаны с восстановлением клеток и реструктуризацией цитоскелета. Наблюдалось высокое обогащение сигнальных путей MARK, фагосом и активации тромбоцитов. Полученные результаты свидетельствуют о реакции рыб на поражение морскими вшами и привлечении компонентов иммунного ответа. В данном случае у вакцинированных рыб были повышены гены миозина, гена, который, как сообщалось ранее, связан с устойчивостью к заболеваниям и миграцией лимфоцитов в эндотелии лосося, инфицированного лососевой вошью L. Salmoni [38,85]. С другой стороны, установлено, что у млекопитающих тромбоциты являются важным компонентом в фазе гомеостаза во время восстановления тканей, и что они участвуют в выработке сигналов для клеток, вовлеченных в последующие стадии воспаления [86,87]. Примечательно, что у S. salar, обработанных кортизолом и зараженных L. salmonis, наблюдалось снижение регуляции тромбоцитарных белков через 18 дней после инокуляции [88]. Большое количество транскриптов связано с путями активации тромбоцитов у рыб, вакцинированных прототипом В, что свидетельствует об улучшении процесса регенерации тканей у рыб, подвергшихся воздействию антигена катепсина.

Исследовательская группа наблюдала за изменения модуляции иммуноглобулинов, MHCII, TLR22 и циклооксигеназы-2 (COX-2) у S. salar, зараженным C. rogercresseyi [52,61,89]. В данном случае группы вакцинированных рыб продемонстрировали активацию иммунного ответа по сравнению с контрольной группой. Например, экспрессия гена COX-2, связанного с воспалительной реакцией [61,90] увеличивается в ткани кожи при всех видах лечения. В то время как в ткани головной почки рыб, которым вводили прототипы В и С, экспрессия гена COX-2 значительно снижалась. У Oncorhynchus gorbuscha наблюдалось увеличение экспрессии MHC II после 24 ч прикрепления L. salmonis [91]. предполагается, что MHCII участвует в реакции S. salar на повреждение кожи, вызванное L. salmonis [92,93]. Однако уровни экспрессии гена MHC II S. salar, зараженного C. rogercresseyi, не показали существенных различий у незараженной контрольной группы [94,95]. Только чрез 14 дней после инокуляции C. rogercresseyi экспрессия гена MHC II увеличилась в головной почке и тканях кожи S. salar [52]. С другой стороны, согласно исследованиям S. salar происходит активация TLR22 в ответ на C. rogercresseyi [61,96]. В данном исследовании повышение уровня TLR22 и MHCII S. salar в коже групп, которым вводили прототипы A и B, свидетельствует о том, что реакция на морских вшей улучшила связь с прототипами вакцины.

Прототипы А и В показали повышенную регуляцию IgT в головной почке, в то время как прототип А имел значительное увеличение экспрессии IgM в коже. Кроме того, у вакцинированных рыб наблюдались изменения в экспрессии иммуноглобулинов. Наблюдалось также увеличение экспрессии иммуноглобулинов у рыб, вакцинированных sea iPath^® и антигеном TT-P0 [35,41,79]. Предполагается активация генов Ig вследствие вакцинации рыб предлагаемыми прототипами.

Ионы металлов играют важную роль в биологических процессах в качестве компонентов метаболизма, ферментативных кофакторов и структурных опор для обеспечения транспорта электронов или иммунного ответа на инфекции патогенов. [97,98,99,100]. Концентрации ионов металлов запускают иммунные реакции во время инфекций патогенами [99,101]. Ионы металлов, такие как Zn и Fe, являются необходимыми микроэлементами для развития патогена, получаемыми от хозяина. Регуляция микронутриентов хозяина — это защитная стратегия, известная как пищевой иммунитет [42,102,103]. Данная стратегия описана у S. salar во время заражения C. rogercresseyi [42]. Также описали изменения экспрессии генов, связанных с гомеостазом железа, у S. salar, подвергшихся воздействию L. salmonis и C. rogercresseyi. Примечательно, что у S. salar, инфицированного C. rogercresseyi, гены, связанные с деградацией гема, были повышены [42]. Описали повышенную регуляцию генов, связанных с гомеостазом железа, во время заражения C. rogercresseyi у предрасположенных к инфицированию видов S. salar по сравнению с устойчивым кижучом [50]. Исследователи продемонстрировали снижение зараженности морскими вшами S. salar, вакцинированных iPath^®, химерным антигеном с функцией переноса железа [41]. У взрослой рыбы, вакцинированной iPath^®, наблюдалось снижение заболеваемости C. rogercresseyi на 96% [41]. Примечательно, что у рыб, которым вводили прототип В, с низким уровнем паразитирования, наблюдалась повышенная регуляция генов биосинтеза группы гема (ALAs, ALAd). Кроме того, у рыб, вакцинированных прототипом В, по сравнению с другими видами лечения, был повышен ген гепсидина. В кожной ткани прототипы А и В демонстрируют высокие уровни экспрессии гена ферритина. Здесь можно предположить влияние антигенов на регуляцию железа S. salar во время заражения морскими вшами.

Выводы

В данном исследовании проанализировали транскриптомную модуляцию S. salar, иммунизированного тремя прототипами вакцины во время ранней стадии инфицирования C. rogercresseyi. Наблюдались паттерны экспрессии, зависящие от прототипа. Прототипы вакцин В и С, оба с антигеном катепсина, показали значительное снижение количества прикрепленных C. rogercresseyi. Кроме того, исследуемые рыбы продемонстрировали высокую модуляцию метаболических процессов и связывания ионов металлов. У рыб, вакцинированных тремя прототипами вакцины, наблюдались модулирующие изменения в биологических процессах, таких как биологическая регуляция, клеточные метаболические процессы и выработка энергии, которые могут иметь основополагающее значение для ответной реакции рыб на ранних стадиях инфицирования C. rogercresseyi.

——

Antonio Casuso, Valentina Valenzuela-Muñoz,  Bárbara P. Benavente, Diego Valenzuela-Miranda and Cristian Gallardo-Escárate. Exploring Sea Lice Vaccines against Early Stages of Infestation in Atlantic Salmon (Salmo salar).  Vaccines (Basel). 2022; 10(7): 1063