Цикл статей представляет собой перевод научной работы — Jaime Orellana. Identification and quantification of suspended solids and their effects in modern marine recirculation systems. Leibniz — Institut für Meereswissenschaften. Kiel, 2006.

2.11. Бактерии в RAS

Другим источником твердых загрязнений в аквакультуре является микрофауна (Chenet al., 1994). Замкнутая система с рециркуляцией представляет достаточно органики для роста бактерий в толще воды, в бассейне, на стенках и трубах.

2.11.1. Число бактерий, биомасса и процент выживаемости

Для исследования бактериальной популяции в культуральной воде (число, биомасса и процент выживаемости) брали образцы из пеноотделительной колонки и емкости сбора пены. Число бактерий определяли двумя методами.

2.11.1.1. Метод 1. Общее число бактерий и бактериальная биомасса

Для подсчета общего числа бактерий использовали эпи-флюоресцентную микроскопию (Zeiss®, модель Axiophot-Axioplan, с HBO 50 W ртутной лампой). Эпи-флюоресцентный микроскоп освещает окрашенный образец светом со специфической длиной волны. Образец (т.е. краситель) абсорбирует свет с заданной длиной волны, излучает свет с меньшей энергией с более длинной волной. Эта эмиссия называется флюоресценцией. Флюоресцирующие клетки под микроскопом ярко светятся на темном фоне. В качестве красителя использовали акридин оранжевый. Это очень простой краситель для ДНК и РНК. Акридин оранжевый взаимодействует с ДНК путем встраивания акридинового ядра между парами оснований. Абсорбция акридина оранжевого находится в диапазоне 440-480 нм (синий), эмиссия – между 520 нм (зеленый для ДНК) и 650 нм (оранжевый для РНК). Краситель окрашивает живые и мертвые клетки.

Образцы брали в 100 мл стеклянные бутылки Амбера. Ранее бутылки промывали свободной от загрязнений (фильтрованная через нитрат-целлюлозный фильтр, 0.2 мкм поры, Sartorius®) бидистиллированной водой и высушивали при 70°C. Непосредственно после взятия, образцы фиксировали, добавляя 37% формалина. Предварительно формалин пропускали через нитрат-целлюлозный фильтр (диаметр поры 0.2 мкм, Sartorius®) и очищали от частиц. На 50 мл образца приходилось 1 мл формалина. Раствор хранили в темноте при комнатной температуре 20°C. Для окончательной фильтрации и окрашивания образца использовали поликарбонатный фильтр диаметром 25 мм (Sartorius®), с покрытием иргалана черного против автофлюоресценции и обеспечения черного контрастного фона. Фильтры помещали в установку для вакуумной фильтрации (тип Witt). Образцы (1-3 мл) фильтровали при -150 мегабар. После этого, вносили 1 мл акридина оранжевого и оставляли на 5 минут. Оставшийся раствор на фильтре удаляли с помощью вакуумного отсоса. Фильтр сушили при комнатной температуре (20°C). Наконец, фильтр помещали на предметное стекло, фиксировали каплей Cargille® иммерсионного масла и накрывали покровным стеклом. Фиксированные образцы хранили при -8°C.

Для подсчета и измерения бактерий использовали решетку New Porton G12 (Graticules LTD., UK) (Рисунок 25). Так как бактерии на фильтре имели распределение по Пуассону, подсчет вели с учетом случайного распределения по поверхности фильтра. Учитывали края и центр фильтра. На рисунке 26 показано два способа просмотра фильтра при подсчете. Если присутствуют частицы, они должны покрывать более 50% поля зрения. В целом, для получения надежных результатов подсчитывали 400 бактерий. Общее число клеток вычисляли по формуле (10):

Bn: число бактерий (N/мл); M: среднее число бактерий при подсчете (N); mf: фактор микроскопа (367455.41); df: фактор разведения; V: объем фильтруемого образца (мл)

Решетка Porton G12 (Рисунок 15) имеет 11 окружностей различного диаметра, от 0 (диаметр 0.2 мкм) до 10 (диаметр 7.6 мкм). Они предназначены для измерения клеток и определения биомассы бактерий. Также можно определить форму клеток: палочка (бациллы), сферы (кокки) или спиральные (спириллум). Объектив устанавливается с одним или комбинацией двух окружностей для определения длины и ширины клетки. С этими двумя измерениями (описаниями) можно рассчитать объем клеток по уравнению 11.

Объем клетки можно рассчитать по уравнению 11:

BV : объем бактерии (мкм3) B∅ : диаметр бактерии (мкм) BL : длина бактерии (мкм)

Как только определили объем клетки, можно рассчитать содержание углерода в каждой бактериальной клетке по уравнению (12) Simon and Azam (1989):

Ccont: содержание углерода (fg); BV: объем бактерии

Наконец, по уравнению 13 определяем среднюю бактериальную биомассу:

BBIO : средняя бактериальная биомасса (мкг C*л-1) Bn : число бактерий (n*mL-1) Ccont : содержание углерода (fg)

2.11.1.2. Метод 2: Чашечный метод подсчета гетеротрофных бактерий

Чашечный метод подсчета гетеротрофных бактерий (HPC) процедура оценки числа живых гетеротрофных бактерий. На стандартную среду культивирования в чашках Петри инокулируют образцы воды с различным разведением. Колонии бактерий появляются от одной клетки, пар или цепочек, все из которых называют колониобразующими единицами (CFU). Колонии можно посчитать после инкубации.

Среду культивирования, морской агар (Zobell 2216), ранее готовили c автоклавированной водой из системы культивирования. 20-30 мл агара наливали в чашку Петри, охлаждали и хранили в темноте при комнатной температуре (20°C). Брали образцы воды и помещали в 100 мл стеклянную бутылку. Стеклянные бутылки ранее стерилизовали как описано в  методе 1. После взятия образцов, время до инокуляции было как можно короче, что избежать ошибок излишнего роста и контаминации бактерий в этот период. Образец воды разводили в семь рядов, начиная с разведения неразведенного образца (разведение 0) до разведения -6, что означает 1 мл образца разводили до автоклавированной водой до 1/1000000. Образец непосредственно из пеноотделительной колонки разводили до -8, что означает 1 мл образца разводили автоклавированной водой до 1/100000000. Объем 100 мкл каждого разведенного раствора инокулировали на три чашки с агаром. После инокуляции, чашки помещали в пластиковые коробки и хранили в темноте при комнатной температуре (20°C) в течение 7 и 14 дней, соответственно. Первый подсчет проводили через 7 дней, второй проводили еще через 7 дней. Для надежного определения общее количество колониеобразующих единиц (CFU) на каждой чашке должно составлять от 30 до 300.

Наконец, с помощью уравнения (14) определили общее число CFU на 1 мл:

CFU : колониеобразующие единицы (CFU/мл); Bcount : среднее число бактерий на чашке; df : фактор разведения; vf : фактор объема.

2.11.2. Микроскопия бактерий

Образцы бактерий изучали под микроскопом с использованием сканирующего электронного микроскопа (см. 2.9.). В этом случае, образцы сначала обрабатывали серией растворов этанола, 30%, 50%, 70%, 90% и, наконец, трижды в 100% ванне, затем водой. После этого, образцы сушили по методу сушки в критической точке. Этот метод позволяет избежать разрушения или деформации влажных структур образца, не образует раздела фаз жидкость/газ. Таким образом, у бактерий не образуется сил поверхностного натяжения. Затем на фильтры наносили напыление, как описано в части 2.10. и рассматривали образцы под электронным микроскопом. Для последующего анализа брали наборы для черно-белых изображений.

2.12. Поток воды в RAS

Как объясняли в части 2.2, RAS построена как низконапорная  (низкое потребление энергии), поток воды обеспечивается только разницей высоты жидкости от работы аэрлифтной системы. По этой причине невозможно включить расходометр, потому что давление воды недостаточно для смещения конуса внутри прибора.

Поэтому использовали ультразвуковой расходометр (Prosonic®, модель Flow DMU 93). Прибор измерял разницу времени перемещения. Акустический сигнал (ультразвук) проходил от одного датчика к другому. Затем измерялось время (прохождение), которое сигнал тратил на прохождение. Различие времени прохождения прямо пропорционально скорости потока. Наконец, поток рассчитывали по формуле Q=v*A (Q = объем потока, v = скорость потока и A = площадь поперечного сечения трубы). На рисунке 27 изображено крепление расходометра к трубе.

Расходометры установили в двух точках в RAS: на выходе из бассейнов с рыбой и выходе из биофильтра. Первая точка выбрана для определения скорости оттока воды из бассейнов. Вторая точка выбрана потому, что аэрлифт, установленный на входе биофильтра, зависит от работы источника воздуха. Этот источник воздуха регулируется клапаном в зависимости от показателей расходометра. Клапан для источника воздуха имеет несколько уровней настройки от 100 до 900 л/час (шаг 50 л/час) и скорость водного потока считывается расходометром.