Исследование посвящено разработке УЗВ с нулевым сбросом воды, более высоким качеством воды высокой продуктивностью, выживаемостью и ростом гидробионтов. Работа состоит из двух этапов: 1. Пилотный проект для оптимизации производства креветок, с использованием гибридной ZWD-RAS системы общим объемом 2.7 м³ и различной плотностью посадки креветок (500, 750 и 1000 постличинок (PL)/м³); 2. Промышленный проект на ферме в Гресике, Восточная Ява, общим объемом 110 м³ и оптимальной плотности посадки, определенной в первом эксперименте.

Как лабораторный, так и промышленный проекты включали 5 этапов: 1. Подготовка и установка компонентов УЗВ и ZWD; 2. Подготовка микробных компонентов, включая нитрифицирующие бактерии, микроводоросли Chaetoceros muelleri, и пробиотические гетеротрофные бактерии Bacillus megaterium; 3. Акклиматизацию креветок ваннамей на постличиночной стадии при солености 32 мг/мл до 5 мг/мл; 4. Подготовка биофильтра УЗВ и бассейна (манипуляции с микробным сообществом в ZWD); 5. Выращивание креветок в течение 84 дней и 60 дней для лабораторной и промышленной систем, соответственно. Гибридная система состоит из ZWD и RAS систем. В бассейны с креветками вносили микробные компоненты для ZWD в начале периода культивирования. RAS работала, когда уровень NH₄⁺ и NO₂—N в бассейне превышал 1 мг/л и до момента снижения до 0-0.5 мг/л. Показатели культивирования в лабораторной системе при плотности посадки 500 постличинок на 1 м³; 750 PL/м³ и 1000 PL/м³ значимо не влияли на окончательную массу (12.06±5.72, 11.84±3.58, 12.04±3.71 г/особь, соответственно) и продуктивность (4.205±0.071, 4.691±0.025, 4.816±0.129 кг/м³, соответственно). Плотность посадки значимо влияла на выживаемость (70±7%, 53±3%, 40±4%, соответственно) и кормовой коэффициент перевода (1.54±0.01, 1.82±0.00, 2.16±0.03, соответственно). Параметры качества воды и микробная нагрузка в ходе эксперимента в лабораторной системе находились на допустимом уровне. Результаты показали, что ZWD-RAS система способна поддерживать качество воды и микробную нагрузку вплоть до посадки 1000 PL/м³; однако, оптимальные показатели выживаемости, кормового коэффициента перевода и продуктивности получены при плотности посадки 500 PL/м³. Эксперимент в промышленно масштабе при оптимальной плотности посадки 500 PL/м³ показал сравнимую выживаемость 78% и общую производительность 298 кг биомассы креветок (эквивалентный уровень продуктивности 2.7 кг/м³). Результаты исследований в лабораторной и промышленной экспериментальных системах показали, что гибридная ZWD-RAS система обеспечивает оптимальные выживаемость и развитие при плотности посадки 500 PL/м³, и имеет потенциал для товарного выращивания креветок в условиях низкой солености.

1. Введение

Ракообразные являются второй по размеру группой, представленной в аквакультуре, уступая лишь рыбам. Они вносят существенный вклад в высокие темпы развития пищевой промышленности, с ежегодным приростом 8.6%. В 2014 году выращивание ракообразных в Индонезии превышало 610000 тонн или примерно 10% мирового производства ракообразных (FAO, 2016). Индонезия произвела более 353000 тонн креветок в 2015 году, и в 2020 году этот показатель увеличится до 506000 тонн (Ipsos, 2016), соответствуя 15% общемировой аквакультуры (FAO, 2016). Выращивание Белой креветки или ваннамей (Litopenaeus vannamei) сейчас составляет примерно 75% от общего производства креветок в Индонезии (FAO, 2016).

Среди техник выращивания ваннамей в Индонезии по-прежнему преобладают традиционные проточные системы и земляные пруды на открытом воздухе. Несмотря на относительную простоту и дешевизну, они имеют ряд недостатков, среди которых недостаточный контроль качества воды, проблемы биобезопасности, вспышки заболеваний. Они обуславливают непредсказуемые результаты культивирования (Otoshi et al., 2003). Вызовом для организации аквакультуры креветок являются экологические проблемы, загрязнение неорганическими азотистыми соединениями, преимущественно, аммонием (NH₄⁺) и нитритом (NO₂^—), которые токсичны для водных организмов и ведут к эвтрофикации водной экосистемы (Eng et al., 1989). Для решения этой проблемы необходимо разработать новую стратегию производства креветок и немедленно внедрить её в индустрию. Она должна учитывать баланс трех основных компонентов стабильной аквакультуры: экономический, социальный и экологический.

Замкнутая система культивирования управляемая, экологически ориентированная, позволяет поддерживать высокое качество воды и обладает гибкостью в плане выбора места установки и размеров культуры. В индустрии распространено два типа замкнутых систем: 1. Рециркуляционная система (RAS) и 2. Система с нулевым сбросом воды (ZWD) или технологией биофлокулята (biofloc) (Funge-Smith & Phillips, 2001). Принцип работы RAS заключается в последовательной обработке загрязненной воды: 1. Фильтрация включает физическую и механическую очистку, использование протеинового скиммера для удаления мелких органических белковых соединений и активированного угля для абсорбции токсичных веществ; биофильтрацию для удаления токсичного аммония и нитрита; 2. Дезинфекция и 3. Оксигенация перед возвратом воды в культуральные бассейны. Хотя RAS может поддерживать стабильное качество воды длительное время, затраты на её эксплуатацию велики, в основном, на электричество (Suantika et al., 2003). Это делает систему малопривлекательной для нужд фермерства.

С другой стороны, в ZWD или в системе с биофлокулятом качество воды поддерживается путем манипуляций с микробным сообществом в бассейне с креветками. Микроорганизмы участвуют в процессах очистки воды, контроле бактерий и сами являются источником корма (Suantika et al., 2015). В описанной Suantika et al. (2015) ZWD системе качество воды поддерживается манипуляциями с микробным сообществом, включая (1) Bacillus megaterium для улучшения аммонификации из органики; (2) нитрифицирующие бактерии для перевода токсичного аммония в менее токсичный нитрат; (3) микроводоросли Chaetoceros muelleri для захвата нитрата, повышения концентрации растворенного кислорода (DO), затемнения бассейна и в качестве источника корма для креветок. Хотя операционные затраты на поддержание качества воды в ZWD системе относительно низкие, её вместимость недостаточно велика для длительного поддержания супер-интенсивной культуры креветок/рыб (Suantika et al., 2015). Поэтому, необходимо изучить применение обеих систем и гибридной технологии, и взаимно устранить их недостатки. Работа посвящена оценке гибридной ZWD системы с точки зрения обеспечения качества воды, роста и выживаемости, продуктивности супер-интенсивной культуры креветок ваннамей в условиях низкой солености.

2. Материал и методы

2.1. Лабораторные эксперименты

2.1.1. Создание гибридной ZWD-RAS

Гибридная ZWD-RAS система создана путем совмещения двух стратегий культивирования креветок – RAS и ZWD. На начальном этапе, гибридная система запущена как ZWD, в которой сброс воды не производят до тех пор, пока сохраняется качество воды. В ZWD вносили воду только для компенсации потерь от испарения. RAS функционировала для поддержания качества воды, значений NH₄⁺ и NO₂^— в бассейнах на уровне 0.5 и 1.0 мг/л. В системе RAS проходил ряд процессов обработки воды, перед её попаданием в бассейны с креветками. Эти процессы включают механическую фильтрацию, удаление белка в скиммере, фильтрацию через активированный уголь и биофильтрацию (Suantika et al., 2003).

2.1.2. Подготовка компонентов гибридной ZWD-RAS

Система состоит из нескольких отделов: 1. Девять 500 литровых цилиндрических стекловолоконных бассейнов с плоским дном. Каждый бассейн оборудован аэрацией через пористый камень; 2. Один 100 литровый прямоугольный отстойник, оборудованный ковром для механической фильтрации выходящего потока; 3. Один 100 литровый протеиновый скиммер для удаления мелких органических частиц; 4. Одна 50 литровая емкость с угольным фильтром для удаления загрязнений и 5. Один 1000 литровый цилиндрический биофильтр с плоским дном, снабженный аэрацией. В биофильтр инокулировали нитрифицирующее бактериальное сообщество для разложения аммония и нитрита в выходящей воде.

2.1.3. Культивирование и активация микробных компонентов: нитрифицирующие бактерии, megaterium и Chaetoceros muelleri

Микробные компоненты, используемые в ZWD системе, включали: 1. Хемоавтотрофные нитрифицирующие бактерии — окисляющие аммоний бактерии (AOB) и нитрифицирующие окисляющие бактерии (NOB); 2. Гетеротрофы B. megaterium и 3. Фотоавтотрофы – морские диатомовые C. muelleri. Все бактериальные изоляты получены в Лаборатории анализа водной экосистемы, Школе Естественных наук и Технологии, Индонезии. Сообщество нитрифицирующих бактерий использовали для обеспечения процессов нитрификации в ZWD. Маточную культуру нитрифицирующих бактерий вырастили в среде Виноградского и масштабировали до 100 литров с использованием 5 млрд^-1 разведенной морской воды с 30% CaCO3 и аэрацией. Источником неорганического азота выступало 2 мг/л NH₄Cl, его вносили в бактериальную культуру (Suantika et al., 2015) (Рисунок 1).

B. megaterium культивировали в 8 г/л питательном бульоне при комнатной температуре в течение 24 часов, а затем масштабировали в 12 г/л коммерческом бульоне в течение 24 часов (Suantika et al., 2015). C. muelleri культивировали в 0.1% среде Walne (v/v) и 0.1% 30 г/л силиката натрия (Na2SiO3) при уровне солености 5 млрд^-1 (Suantika et al., 2015).

2.1.4. Подготовка биофильтра RAS и микробного цикла ZWD

Подготовка 600 литрового биофильтра проводилась инокуляцией 40 литров бактериальной суспензии плотностью 10⁶ кое/мл в стерилизованной морской воде соленостью 5 млрд^-1. Субстратом для бактерий служило 75 кг известняка диаметром 3-4 см. Для затемнения биофильтра и повышения площади поверхности субстрата вносили плавучие пластиковые шарики. Биофильтр активировали внесением 3 г NH₄Cl (эквивалентно 5 мг/л NH₄⁺). Как только концентрация NH₄⁺ снижалась до 0 мг/л, в биофильтр вносили дополнительные 6 г NH₄Cl (эквивалентно 10 мг/л NH₄⁺). Готовность к работе достигалась, когда уровень NH₄⁺ и NO₂^— находились в диапазоне 0-0.5 мг/л, AOB и NOB уже активно окисляли аммоний до нитрита и нитрата, соответственно (Suantika et al., 2016).

На начальном этапе бассейн с креветками функционировал как ZWD система. ZWD готовили, внося 300 литров стерилизованной разбавленной морской воды соленостью 5 млрд^-1 в каждый 500 литровый бассейн. На дно бассейнов засыпали 12.5 кг известняка диаметром 3-4 см для образования пленки нитрифицирующих бактерий. Известняк обладал кислотными буферными свойствами, вследствие закисления, которое происходит от органической кислоты, выделяемой в процессе гниения (Suantika et al., 2016). Позднее, в бассейн инокулировали 10 литров нитрифицирующих бактерий, состоящих из AOB и NOB в концентрации 10⁶ КОЕ/мл, и 0.3 г NH₄Cl (эквивалентно 1 мг/л NH₄⁺) в каждый бассейн в качестве источника аммония. При активации AOB и NOB, происходило снижение NH₄⁺ и NO₂^— до 0-0.5 мг/л и возрастание NO₃^—. После этого вносили 0.1% (v/v) культуру C. muelleri (плотность 106 клеток/мл) и 150 мл B. megaterium (плотность 10⁷ КОЕ/мл). Воду в системе перемешивали и оксигенировали двумя камнями для аэрации (76 мл O₂/сек каждый). Система была готова к использованию, как только окраска воды становилась коричневатой, и в бассейне с креветками плотность диатомовых водорослей достигала 104 клеток/м. Перед заполнением бассейнов в них поместили лотки для кормления с сеткой ячейкой 1.3 мм (Рисунок 2) (Suantika et al., 2015).

2.1.5. Акклиматизация креветок на постличиночной стадии 10 дней после вылупления (PL10)

Креветки на стадии PL10 использованы в работе. Они получены в Suri Tani Pemuka, Indramayu, Западная Ява, Индонезии. Акклиматизация проводилась постепенным внесением стерилизованной водопроводной воды и снижением солености с 32 млрд^-1 до 5 млрд^-1 за 13 дней (±2 млрд^-1/день).

2.1.6. Установка системы и её работа

В гибридной RAS-ZWD системе вода самотеком проходит из бассейна с креветками в отстойник, затем в протеиновый скиммер и емкость с активированным углем. Затем вода очищается в биофильтре, где аммоний и нитрит переходят в нитрат (Suantika et al., 2003). Схема лабораторной гибридной ZWD-RAS представлена на рисунке 3.

На начальном этапе, гибридная система работала как ZWD, в которой сброс воды отсутствовал. Для компенсации испарения еженедельно вносили 10% от общего объема стерилизованной морской воды соленостью 5 млрд^-1. Когда уровень аммония и нитрита превышал 0.5 мг/л, качество воды улучшали включением RAS. Прерывистое использование RAS прекращали, когда уровень аммония и нитрита снижалось до 0.0-0.5 мг/л. Скорость циркуляции при работе RAS повышали с 85% до 200% ежедневно (Таблица 3). Бассейны культивирования аэрировали двумя камнями для аэрации (76 мл O₂/сек каждый). Температуру поддерживали на уровне 28±2°C погружаемым электрическим нагревателем (110В/1000Вт). Интенсивность светового дня контролировали LED в диапазоне 1700-1900 люкс на поверхности воды. Во избежание роста цианобактерий, поверхность культурального бассейна накрывали пластиковой сеткой (Neilan et al., 2013).

2.1.7. Внесение креветок и режим кормления

В условиях лабораторной системы плотность посадки креветок PL10 – составляла 500, 750 и 1000 PL/м³. Культивировали в течение 84 дней. Каждый режим посадки проводился трижды. Кормление проводилось «вслепую» на основе оценки средней массы креветок, выживаемости и принятия корма.

Ежедневное кормление (г) = SD * MBW * FR * SR, где SD – начальная плотность посадки, MBW – средняя масса креветок (г), SR – оценочная выживаемость (%), FR – режим кормления. Оценочная выживаемость и норма кормления для каждой размерной группы получены из работы Tacon et al. (2013). Порции корма вносили в фиксированные промежутки времени – 9:00, 12:00, 16:00, 21:00. Корм помещали на лотки, которые регулярно проверяли и оценивали прием корма креветками. Стратегия кормления представлена в таблице 1.

2.1.8. Измерения физико-химических параметров воды

Дважды в неделю с помощью мультиметра YSI 556 (YSI Incorporated, Yellow Springs, OH) измеряли pH, температуру, растворенный кислород, соленость. Измерения NH₄⁺, NO₂^—, NO₃^— проводили методами Несслера, диазотизации и HCl, соответственно (Eaton & Franson, 2005).

2.1.9. Измерения микробиологических параметров

Измерения микробиологических параметров проводили один раз в неделю с использованием чашечного метода (TPC) на образцах воды (Neilan et al., 2013). Для каждой экспериментальной группы отбирали 50 мл воды и объединяли. Микробный анализ объединенного образца проводили трижды. Гетеротрофные бактерии подсчитывали посевом после серии разведений культуральной воды на питательном агаре (NA), тогда как общее число Vibrio подсчитывали посевом на тиосульфат-цитратный агар с сахарозой и желчью (TCBS).

Общее число бактерий рассчитывали по уравнению (Cappucino & Sherman, 2011):

Общее число (КОЕ/мл) = ∑колоний * (1/фактор разведения) * (1/объем). Бактериальные изоляты, которые появлялись в процессе подсчета очищали и идентифицировали молекулярными методами. Идентификация включала 4 этапа: экстракция ДНК коммерческим набором Qiagen DNeasy для крови и тканей; амплификация ПЦР с праймерами 27F/1492R; секвенирование бактериального гена рРНК 16S с использованием праймера 785F/907R; проверка гомологичных последовательностей по базе нуклеотидных последовательностей BLAST против GenBank и Ribosomal Database Project (RDP) (первые три этапа проведены в Macrogen Inc.,Корея). Результаты проверяли с помощью филогенетического анализа с использованием программы Winclada метода Ratchet (Island Hopper) (Suantika et al., 2017).

2.1.10. Измерение биологических параметров

Биологические параметры культивирования оценивали по показателям производства креветок в течение 84 дней. Они включали выживаемость (SR), коэффициент перевода корма (FCR), общую биомассу на бассейн (Suantika et al., 2015):

?? = ?*?/?? × 100%, где ?? – выживаемость, ?? – начальное количество креветок, ?? – окончательное количество креветок, t – время культивирования.

2.1.11. Статистический анализ

Все данные обрабатывали с помощью однофазного дисперсионного анализа (ANOVA) с Tukey и hoc анализом.

2.2. Промышленный эксперимент

По аналогии с лабораторной системой, в RAS-ZWD промышленной системе вода физически фильтровалась в одном 2000 литровом прямоугольном отстойнике, нагнеталась в два протеиновых скиммера (Рисунок 4a), затем в один 250 литровый резервуар с активированным углем (Рисунок 4b). Позднее, вода попадала в 6000 литровый бетонный прямоугольный биологический фильтр с плоским дном (Рисунок 4c). После этого, она устремлялась в 8 прямоугольных бассейна с креветками общим объемом 112 тонн: 7 бассейнов размером 4*4*0.8 м и один бассейн размером 4*3*0.8 м (Рисунок 4d). Схема гибридной RAS-ZWD промышленного уровня представлена на рисунке 5.

Креветки PL10 вылавливали из Suri Tani Pemuka, Banyuwangi, Западная Ява, Индонезия, и помещали в 100 литровые контейнеры с аэрацией и хорошим перемешиванием. Особей осматривали и подсчитывали. В промышленных масштабах гибридная ZWD-RAS система имела плотность посадки креветок 500 PL/м³ и схожий с лабораторными экспериментами режим кормления (Таблица 1). Аэрация и обновление воды проводились по аналогии с лабораторной установкой. В ходе 60 дней культивирования параметры качества воды (температура, pH, DO, NH₄⁺, NO₂^—, NO₃^—) еженедельно проверяли. Температуру, pH и DO измеряли непосредственно в воде с помощью мультипараметрического метра YSI 556 (YSI Incorporated, Yellow Springs, OH). Измерения NH₄⁺, NO₂^— и NO₃^— проводили методами Несслера, диазотизации и HCl, соответственно (Eaton & Franson, 2005). По окончании 8 бассейнов и объединяли. Определяли ростовые параметры креветок – конечную общую биомассу, среднюю конечную массу креветки.

3. Результаты и обсуждение

3.1. Лабораторная система

3.1.1. Подготовка биофильтра (RAS) и ZWD

Запуск RAS системы начинали с подготовки биофильтра, как наиболее важного компонента. Уровни NH₄⁺, NO₂^— и NO₃^— в ходе подготовки биофильтра представлены на рисунке 6. На основе показателей нитрификации в процессе запуска установлено, что биофильтр может утилизировать 15 мг/л NH₄⁺, вносимые каждые 6 дней, до NO₃^— со скоростью 2.5 мг/л в день. Уровень NO₂^— возрастал до 5 дня, а затем постепенно снижался до 0 мг/л на 7 день запуска. В итоге, подготовка заняла 7 дней. Значение 15 мг/л аммония, использованное при запуске биофильтра, соответствует его накоплению в 9 бассейнах с креветками. Один бассейн с креветками производит ежедневно 1.5 мг/л аммония, т.е. во всей системе ежедневно образуется 13.5 мг/л. Этот расчет представлен в работе Muhammad et al. (2016), в которой уровень NH₄⁺ в каждом бассейне ZWD системы достигал 3 мг/л в течение 70 дней культивирования. Включение биофильтра с известковым гравием и биошариками может снизить концентрацию NH₄⁺ на 50% (Suantika et al., 2016). Со снижением уровня аммония отмечена активация сообщества AOB и NOB бактерий в биофильтре. Постепенное снижение NO₂^— и соответствующее возрастание NO₃^— свидетельствует об активности NOB бактерий, окисляющих нитрит (Suantika et al., 2016).

В начале подготовки ZWD системы в бассейны инокулировали сообщество нитрифицирующих бактерий. Затем, для последовательной активации AOB и NOB бактерий вносили 1 мг/л аммония. Уровень NH₄⁺, NO₂^— и NO₃^— в ZWD системе измеряли в культуральных бассейнах (Рисунок 7).

ZWD система может снижать NH₄⁺ с 1 мг/л до 0 мг/л за 5 дней после запуска (распад NH₄⁺ ±0.1 мг/л в день). Нитрит переходит в нитрат в течение 9 дней (±0.1 мг/л в день). Шесть дней запуска ZWD сопровождались максимальным возрастанием NO₃^—, поэтому для его снижения вносили 0.1% (v/v) C. muelleri культуру плотностью 106 клеток/мл. Основным нутриентом для прироста биомассы водорослей является нитрат (Müller-Feuga et al., 2003).

В процессе запуска RAS и ZWD обнаружено, что окисление аммония происходит гораздо быстрее, чем окисление нитрита. AOB растут быстрее, чем NOB (±8 часов против ±12 часов) (Gerardi, 2002). Кроме того, биофильтр обеспечивает более благоприятные условия, pH и соленость для окисления аммония, чем окисления нитрита (Jeon et al., 2010). Активность NOB зависит от концентрации конечного продукта аммонификации, нитрита. Это обстоятельство пролонгировало время подготовки биофильтра и ZWD (Suantika et al., 2016).

3.1.2. Аммоний, нитрит и нитрат

Растворенные формы азота, NH₄⁺, NO₂^— и NO₃^— должны измеряться в ходе культивирования. Концентрации этих веществ за 84 дня представлены на рисунке 8. Уровень аммония стабильно держался в диапазоне 0.5-1.8 мг/л, что ниже уровня токсичности 3.95 мг/л при солености 30 млрд^-1 (Lin & Chen, 2001) или 2 мг/л при солености 10 млрд^-1 (Schuler et al., 2010). Стабильный уровень нитрита достигался в первые 20 дней культивирования. Затем различия концентрации NO₂^— отмечались для трех плотностей посадки. Наибольший уровень нитрита при максимальной плотности посадки 1000 PL/м³ (~3.8 мг/л NO₂^— на 47 сутки), и он снижался при плотности посадки 750 PL/м³ и 500 PL/м³ (3.5 мг/л и 2.1 мг/л, соответственно). Конечный продукт нитрификации, нитрат, накапливался в системе, и максимальная концентрация варьировала в зависимости от плотности посадки от 100 до 150 мг/л. Относительно высокая концентрация нитрата в данной работе обусловлена слабым потреблением его морскими диатомовыми в условиях низкой солености (Gordillo et al., 2002). Уровень накопления нитратов при культивировании был приемлемым для креветок, потому что токсичность отмечена при более 25.7 мг/л и солености 30 млрд^-1 (Lin & Chen, 2003) или 154 мг/л в течение 48 часов LC50 и температуре 29°C, pH 7.9 и солености 10 млрд^-1 (Schuler et al., 2010). Комбинация манипуляцией с микробным сообществом в ZWD системе и циклом очистки воды в RAS привело к относительно стабильному и низкому уровню аммония и нитрита в воде. Ограниченная способность ZWD системы утилизировать аммоний и нитрит при высокой плотности посадки креветок можно компенсировать периодическим включением RAS. Использование гибридной установки для выращивания креветок позволяет одновременно поддерживать высокое качество воды и эффективно использовать дорогую RAS. Концентрации аммония и нитрита при любой плотности посадки находился в допустимых пределах (Lin & Chen, 2001; Lin & Chen, 2003; Schuler et al., 2010), даже не смотря на различия концентрации между системами с плотностью посадки 500 и 1000 PL/м³.

Тем не менее, для длительного сохранения качества воды при высокой плотности посадки необходима RAS. Более высокое накопление органических веществ требует более длительной обработки через RAS. Накопление органики напрямую влияет на возрастание аммония в воде, потому что он образуется при гниении (Ghaly & Ramakrishnan, 2015). В гибридной системе с высокой плотностью посадки RAS приходится включать чаще. В данной работе при плотности посадки 500, 750, 1000 PL/м³ продолжительность работы RAS составляла – 484, 643 и 684 часа, соответственно (Таблица 3).

Более высокая плотность посадки требовала более длительного времени циркуляции, потому что образуется больше органических загрязнений. Последние образуются из несъеденного корма и фекалий. В таблице 4 приведены значения TAN (общего аммонийного азота), образуемого в ходе кормления креветок в течение 84 дней (Somerville et al., 2014). Показано, что поступление NH₄⁺ при более высокой плотности посадки выше. Так как ZWD система имеет ограниченные возможности окислять NH₄⁺ (Suantika et al., 2015), при высокой плотности посадки необходимы длительные и частые циклы включения RAS.

3.1.3. Микробиологические параметры

В таблице 5 видно, что чашечный метод подсчета показал обилие гетеротрофных бактерий и Vibrio sp. в гибридной системе при трех плотностях посадки – 500, 750 и 1000 PL/м³.

Присутствие бактерий было относительно стабильным и варьировало от 2 log единиц до 5 log единиц для гетеротрофных бактерий и от 1 log до 4 log единиц для Vibrio sp. В этой системе доля гетеротрофных бактерий всегда была больше Vibrio sp. Таким образом, гибридная система способна поддерживать стабильность и баланс среди микробных компонентов в воде. Нагрузка Vibrio в системе (желтых и зеленых изолятов) составляли 10⁴ КОЕ/мл в течение 84 дней культивирования, что почти на 2 log единицы меньше, чем патогенный уровень Vibrio в воде ~10⁶ КОЕ/мл (Pena et al., 2001). Поэтому, использование гибридной системы позволяет поддерживать уровень бактерий Vibrio sp. низким и стабильным. Более частое и длительное включение RAS рециркуляции в группах с высокой плотностью посадки (750 и 1000 PL/м³) обеспечивает стабильность микробной нагрузки в культуре, хотя концентрация органических веществ выше, чем при более низкой плотности посадки (500 PL/м³). Эти подходящие условия культивирования очень важны для стабильности культуры креветок. Использование гибридной ZWD-RAS системы в данной работе позволяет поддерживать Vibrio на низком уровне. Эти бактерии вызывают синдром вибриоза на креветочных фермах (Lavilla-Pitogo et al., 1998).

3.1.4. Разнородность культурального бактериопланктона

Разнородность и доля культуральных бактерий в воде представлено в таблице 6. Из культуральных изолятов идентифицировано 7. Четыре преобладающих вида (>10%), включали Brevibacterium sanguinis (40.89%), Shewanella seohaensis (25.6%), Staphylococcus saprophyticus (16.67%), Acinetobacter radioresistens (15.92%). Brevibacterium sp. обычные бактерии из кишечника креветок (Goodwin, 2005). Они выделяют полигидроксил бутират биополимер (PHB), действующий против патогенов Vibrio (Kiran et al., 2014). Shewanella sp. также внутренний пробиотик, ингибирующий патогенных Vibrio (Suantika et al., 2013). В кишечнике ваннамей обычно обнаруживаются Staphylococcus (Goodwin, 2005). В некоторых условиях, например, высокой плотности посадки креветок, эти бактерии продуцируют энтеротоксин в кишечнике, что представляет опасность для креветок (Beckers et al., 1985). Acinetobacter sp. являются денитрифицирующими бактериями и рассматриваются в качестве альтернативы для удаления нитрита в интенсивной аквакультуре креветок (Cao et al., 2012). Наблюдения разнородности и доли бактерий позволили сделать вывод, что в основном это пробиотики.

3.1.5. Индекс разнородности

В интенсивной культуре креветок очень важны стабильность и предсказуемость бактериальной разнородности. В этой работе низкий и стабильный уровень разнородности от 0 до 1 сохранялся в период культивирования (Таблица 3). Низкий и стабильный уровень разнородности указывает на то, что ZWD-RAS минимизирует непредсказуемые падения культуры, обусловленные неожиданной сменой структуры бактериального сообщества и ухудшением качества воды. В этой системе структура бактериального сообщества в основном состояла из функциональных бактерий, таких как Brevibacterium sanguinis и Shewanella seohaensis, известных как пробиотики в культуре креветок. Контролируемая структура сообщества и разнородность, включающая преимущественно пробиотики, создают подходящие условия культивирования (Suantika et al., 2015). Концепция разнородности особенно важна, потому что обычно характеризует естественные или организованные сообщества (Hairston, 1959). Разнородность улучшает стабильность сообщества и связанные с ней продуктивность, интеграцию, эволюцию, нишевую структуру и конкуренцию (Fisher et al., 1943). Индекс разнородности в гибридной системе ZWD-RAS отражен в таблице 7.

В данной работе индекс оказался низким, менее единицы (H’<1) (Sudarma & Suprapta, 2011). В процессе культивирования рост бактерий продолжался, но непрерывное удаление органики и водоподготовка контролировали этот процесс (Suantika et al., 2003).

3.1.6. Динамика состава культурального бактериопланктона
3.1.6.1. Плотность посадки 500 PL/м³

Динамика развития бактериального сообщества в гибридной ZWD-RAS при плотности посадки 500 PL/м³ представлена на рисунке 9. В ходе 4-х недель культивирования отмечались флуктуации микробного сообщества, включающего 4 вида — S. seohaensis, S. saprophyticus, B. casei, M. aquaticum. С 5 недели ситуация стабилизировалась, когда преобладающими становились бактерии S. seohaensis и S. Saprophyticus. Они доминировали, потому что представлены в кишечнике креветок (Goodwin, 2005).

Высокая доля S. seohaensis и S. saprophyticus — 20.24 (до 70.2% и 20.24%, соответственно) в бактериальном сообществе улучшает условия культивирования, потому что повышает выживаемость креветок (особенно, Shewanella). Shewanella эндогенная бактерия, присутствовала каждую неделю культивирования. Её присутствие оказывало позитивный эффект на креветок посредством контроля патогенных бактерий в воде и биопленке. Позитивное влияние обусловлено продукцией бактериоцина и пиомеланина (пигмента) (Suantika et al., 2013). Индекс схожести сообществ бактерий показал одинаковую долю бактерий на протяжении 84 дней культивирования, хотя схожесть снижалась из-за присутствия B. sanguinis на 10 неделе (Рисунок 10).

3.1.6.2. Плотность посадки 750 PL/м³

Динамика развития бактериального сообщества в гибридной ZED-RAS, при плотности посадки 750 PL/м³ представлена на рисунке 11. В течение 7 недель культивирования бактериальное сообщество преимущественно состояло из двух видов S. seohaensis и S. saprophyticus. Эта структура изменилась, когда культура вошла на 8 и 9 недели, где появился новый вид B. casei. С 10-12 недели B. sanguinis появились и почти заменили S. seohaensis в культуре. Бактериальные виды, вовлеченные во взаимодействия в культуре креветок, такие как S. seohaensis и B. sanguinis, полезны для культивирования. Известно, что S. seohaensis могут улучшить выживаемость креветок (Suantika et al., 2013), тогда как B. sanguinis продуцирует PHB, ингибирующий патогенность Vibrio (Kiran et al., 2014).

Преобладающими видами при данной плотности посадки были S. sanguinis (52.42%), S. seohaensis (22.89%) и A. radioresistens (14.92%). Все роды бактерий играют витальную роль в культуре креветок, потому что они контролируют патогенетические бактерии в воде. Brevibacterium сильно подавляют Vibrio sp. с помощью PHB, подавляя нарастание биопленки и/или адгезию вибрионов (Kiran et al., 2014). Схожесть кластерного анализа (рисунок 12) свидетельствует о том, что все культуральные бактерии в сообществе на протяжении 84 дней выращивания относились к одной группе. Существенных колебаний состава бактериального сообщества не наблюдалось, так как индекс схожести составлял более 50% на еженедельной основе. Качество воды в гибридной ZWD-RAS системе оставалось стабильным. Стабильность концентрации азотистых соединений, pH, DO и т.д. обеспечивает благоприятные условия культивирования и баланс взаимодействия среди бактериальных компонентов в культуре (Suantika et al., 2015).

3.1.6.3. Плотность посадки 1000 PL/м³

Динамика развития бактериального сообщества в гибридной ZWD-RAS при плотности посадки 1000 PL/м³ представлена на рисунке 13. На протяжении 8 недель культивирования бактериальное сообщество было относительно стабильным, когда доминирующим видом выступали S. seohaensis. Начиная с 10 недели, в культуре появился новый вид B. sanguinis и с 12 недели стал преобладать. В этой работе присутствие S. seohaensis в процессе культивирования поддерживает рост креветок, потому что этот род способен контролировать патогенные бактерии и поддерживать синергическое взаимодействие с другими бактериальными компонентами (Suantika et al., 2013).

Согласно кластерному анализу схожести сообщества, состав бактерий в культуре не менялся (индекс схожести выше 50). Хотя появление B. sanguinis на 10-12 неделе понизил схожесть сообщества по сравнению с предыдущими неделями (Рисунок 14).

3.1.7. Доля культуральных бактерий в гибридной ZWD-RAS системе при всех плотностях посадки

Присутствие и доля культуральных бактерий, наблюдаемых в ZWD-RAS, при всех плотностях посадки в течение 84 дней выращивания представлены в таблице 8. При любой плотности посадки из воды выделено 7 культуральных бактерий. Бактерии S. seohaensis и S. saprophyticus всегда преобладали (доля более 10%) во всех группах с различной плотностью посадки. В данной работе это свидетельствует о том, что S. seohaensis могут повысить выживаемость креветок при плотности посадки 500 PL/м³, вследствие ингибирования патогенных бактерий, Vibrio sp. (Suantika et al., 2013). Доля S. seohaensis снижается с увеличением плотности посадки. С другой стороны, Brevibacterium также поддерживают выживаемость креветок, вследствие способности продуцировать PHB против адгезии и образования биопленки Vibrio sp. (Kiran et al., 2014). Хотя последние появлялись только в конце культивирования.

3.1.8. Биологические параметры

Биологические параметры, включающие среднюю массу тела креветок (MBW) и длину, конечную биомассу, выживаемость (SR) и кормовой коэффициент перевода (FCR) представлены в таблице 9. Отсутствовали значимые различия роста креветок (конечная средняя масса тела и длина) во всех группах. Показано, что плотности посадки существенно влияют на выживаемость креветок, где максимальное значение в 70% наблюдалось при 500 PL/м³. Затем следовали 52.5% (750 PL/м³) и 40% (1000 PL/м³).

Падение выживаемости при более высокой плотности посадки может объясняться стрессом от среды, конкуренции за пространство и эффекта скученности (Wickin & Lee, 2002). Этот стресс мог повысить каннибализм среди креветок ваннамей в процессе линьки (Muhammad et al., 2016).

Различия выживаемости существенно влияют на продуктивность креветок. Последняя разнилась в зависимости от плотности посадки, хотя имела тенденцию возрастать с увеличением плотности посадки (4.2 кг/м³, 4.7 кг/м³ и 4.8 кг/м³ при 500, 750 и 1000 PL/м³, соответственно). Выживаемость играет очень важную роль в достижении эффективности культивирования креветок, так как высокая выживаемость повышает общую биомассу и обуславливает более низкий кормовой коэффициент перевода. В данной работе хотя отсутствовали различия конечной MBW в группах, падение выживаемости с ростом плотности посадки приводило к повышению кормового коэффициента перевода (падение эффективности кормления). Перекармливание обусловлено сниженным усвоением/приемом вносимого корма креветками в условиях низкой солености (Perez-Velazquez et al., 2007; Gao et al., 2016). Это свидетельствует о том, что с практической точки зрения управление кормлением в этой работе нуждается в улучшении, посредством более точной оценки действительной биомассы креветок в ходе выращивания, а также модификации рациона (Roy et al., 2010). Значения FCR во всех группах находились на допустимом уровне (ниже 2.6) (Woynarovich et al., 2010). Однако тенденция к возрастанию значений FCR в культурах при высокой плотности посадки говорит о более низкой экономической состоятельности и более высоких затратах на корм (Quintero & Roy, 2010). С позиции фермера ясно, что использование гибридной ZWD-RAS наиболее эффективно при плотности посадки 500 PL/м³, потому что требуется гораздо меньше посадочного материала и корма (соответственно, более низкие операционные затраты), а продуктивность такая же как при плотности посадки вплоть до 1000 PL/м³.

3.2. Эксперименты в промышленных масштабах

3.2.1. Параметры качества воды

Измерения показателей качества воды показали, что они находились на допустимом уровне в культуре креветки ваннамей. Исключением является соленость, так как выращивание проходило при уровне солености 5-6 млрд^-1. Качество воды в промышленной системы аналогичен лабораторной системе. Таким образом, гибридная ZWD-RAS сохраняет качество воды независимо от типа системы. Уровень нитрита возрос за последнюю неделю культивирования и достигал 15 мг/л NO₂^—. В отличие от Nitrosomonas-подобных бактерий, Nitrobacter-подобные бактерии медленнее развиваются и более уязвимы. Они очень восприимчивые и легко повреждаются в ходе химической обработки и изменений качества воды, включая температуру. Спайки нитрита обычно происходят в аквакультурных системах, которые полагаются на нитрификацию с азотным циклом (Wang et al., 2004; Ray, 2012). Это также может происходить, когда размер биофильтра и его пропускная способность не соответствуют промышленной системе. В данной работе подготовка биофильтра, внесение неподвижного, пористого субстрата, повышение площади для нитрифицирующих бактерий позволило увеличить его активную площадь. Обобщенные данные о параметрах качества воды в промышленной системе приведены в таблице 10.

3.2.2. Биологические характеристики

В лабораторных экспериментах была выбрана оптимальная плотность посадки 500 PL/м³ для промышленной системы. Из-за характеристик культуры выживаемость в промышленной системе (78%) была слегка выше, чем в лабораторной системе (70%). Однако период выращивания в промышленном масштабе короче, поэтому можно сказать, что выживаемость аналогичная. Продуктивность промышленной системы после 60 дней выращивания составила 2.71 кг/м³, средняя конечная масса тела 7 граммов. Обобщенные данные биологических параметров в течение 60 дней выращивания в промышленной системе приведены в таблице 11.

Заключение

Результаты лабораторных экспериментов показали, что гибридная ZWD-RAS система способна поддерживать допустимую микробную нагрузку при плотности посадки до 1000 PL/м³. Однако оптимальные продуктивность, выживаемость креветок и FCR достигаются при плотности посадки 500 PL/м³. При этом в течение 60 дней культивирования средняя конечная масса креветок составила 7 граммов и оптимальная продуктивность 2.71 кг/м³. Для улучшения роста и выживаемости в супер-интенсивной культуре и ZWD-RAS системе необходимы дальнейшая оптимизация плотности посадки и кормления.
——
Gede Suantika, Magdalena Lenny Situmorang, Jonathan Berlian Kurniawan et al. Development of a Zero Water Discharge (ZWD) – Recirculating Aquaculture System (RAS) Hybrid System for Super Intensive White Shrimp (Litopenaeus vannamei) Culture under Low Salinity Conditions and Its Industrial Trial in Commercial Shrimp Urban Farming in Gresik, East Java, Indonesia. Aquacultural Engineering. 11-12-2017