Тенденции в возрастании потребления морских кормов и снижения естественного улова диктуют необходимость выращивания значительной части морских продуктов в аквакультуре в 21 веке. Сложность производства экономически больших количеств микроводорослей на корм в настоящее время одно из основных препятствий на пути дальнейшего развития аквакультуры. Традиционные методы, которые базируются на фотосинтетическом росте в прудах «в/вне» помещений под искусственным или естественным освещением, страдают от феномена лимитированной светом биомассы. Некоторые виды микроводорослей способны к гетеротрофному росту. При этом для высокой плотности используются сахара в качестве источника энергии и углерода для клеток. В статье рассмотрены штаммы гетеротрофных водорослей, которые обладают потенциалом, как для приготовления питательного корма, так и для экономического производства путем ферментации.

По материалам: Raymond M. Gladue, John E. Maxey. Microalgal feeds for aquaculture. Journal of Applied Phycology. 6 (2): 131–141, 1994

Введение

По ряду причин, предполагается, что выход морских продуктов в индустрии аквакультуры существенно возрастет в следующие несколько десятилетий. Однако перед этим необходимо преодолеть определенные технические преграды. Одной из наиболее серьезных задач является сложность обеспечения водорослей адекватными условиями культивирования.

Микроводоросли являются первичным источником корма для личинок некоторых ценных рыб и моллюсков. Традиционные методы, используемые для производства кормов из водорослей, зависят от фотосинтетического роста клеток в пруду на открытом воздухе, либо в помещении под искусственным светом. Эти методы имеют одно фундаментальное ограничение: прирост биомассы ограничен проникающей способностью света. С ростом водорослей, биомасса начинает затенять воду. В результате, фотосинтетическая культура редко превышает 0.5 граммов на 1 литр воды. Для культивирования необходимо использовать чрезвычайно большие объемы воды и, соответственно, повышает затраты на энергию, пространство и трудозатраты. Так как в больших объемах трудно контролировать условия культивирования, отмечается различное качество воды, внезапное вымирание культуры и неожиданное загрязнение.

Производство гетеротрофных водорослей может стать альтернативой. Способность расти гетеротрофно продемонстрирована у нескольких видов водорослей. При этом исчезает необходимость в освещении и, следовательно, феномен лимитирования освещением. Гетеротрофные культуры могут расти в стандартных сосудах-ферментерах, используемых в промышленной микробиологии для производства органических кислот, антибиотиков и множества других продуктов. Плотность биомассы теоретически ограничивается только растворимостью питательных веществ (наиболее важный — кислород). Для некоторых микроорганизмов докладывалось о достижении сухой массы более 40 г/л. Существует три первичных целевых организма, которые употребляют водоросли: креветки, двустворчатые моллюски (особенно, морские моллюски и устрицы) и коловратки. Как правило, креветок и моллюсков кормят водорослями лишь короткий промежуток времени на личиночной стадии. Более длительное кормление может быть полезно для этих беспозвоночных, но нецелесообразно из-за дороговизны водорослей. Коловратки, сами по себе, строго не являются целевым организмом, но они используются для кормления личинок морских видов рыб. Иногда коловраток культивируют на дрожжах, однако водоросли обеспечивают лучший рост и выживаемость. В качестве корма для целевых организмов предлагается множество видов водорослей. При этом мало известно о биохимических основах, обуславливающих их питательную ценность.

Гетеротрофное производство водорослей в крупных ферментерах с мешалкой должно снизить стоимость производства и, одновременно, повысить контроль культивирования. Обзор литературных данных, посвященных гетеротрофному питанию микроводорослей, показал, что среди обычно используемых а корм видов лишь немногие члены рода Tetraselmis и Chlorella способны расти на гетеротрофном питании. Chlorella является пресноводной водорослью, которая недавно начала использоваться на корм коловраткам в Японии и других азиатских странах. Однако в ней недостает омега-3 полиненасыщенных жирных кислот (n-3 HUFA). Поэтому на корм она может использоваться только с добавлением этих важных жирных кислот. Tetraselmis, хотя и используется при кормлении всех трех целевых организмов, не является идеальным продуктом. Другие рода водорослей (т.е. Nitzschia, Cyclotela, Chlamydomonas, Scenedesmus, Ochromonas, Euglena, Chroomonas, Gyrodinium) растут в гетеротрофных условиях, однако не используются на корм.

Наиболее важными качествами водоросли являются её способность поддерживать рост и высокую выживаемость целевого организма, а также иметь экономическую целесообразность производства. Эти два критерия слабо освещены в литературе.

В данной статье рассмотрен ряд факторов, которые позволяют спрогнозировать потенциальную успешность развития определенного штамма водоросли в качестве корма.

Факторы, сильно влияющие на экономичность производства в качестве корма, включают:

1. Скорость роста. Быстрый рост снижает стоимость;
2. Солеустойчивость (Halotolerance). Рост водорослей в условиях низкой солености снижает коррозию сосуда ферментера из нержавеющей стали, однако она должна обладать солеустойствостью при помещении в емкость с целевым организмом;
3. Низкая оценочная стоимость производства. Привередливые организмы, требующие питательного корма или чувствительные к изменению условий в ферментере, обуславливают чрезвычайно высокую стоимость оборудования для контроля или трудозатраты. Дорогие питательные среды также повышают затраты;
4. Высокая плотность культуры. Некоторые микроводоросли образуют, ингибирующие их рост, продукты, которые ограничивают плотность биомассы. Более высокая плотность культуры снижает стоимость её сбора;
5. Сопротивление сдвигу. Обычно лимитирующим фактором при высокой плотности биомассы в аэробном ферментере становится кислород. Для обеспечения адекватного перемешивания и переноса кислорода культура должна энергично встряхиваться. Ломкие водоросли не выдерживают таких жестких условий;
6. Приготовление. Водорослевые клетки, которые устойчивы к лизису даже после длительного периода вымораживания, легко доставляются к потребителю;

Факторы прогнозирования питательной ценности гетеротрофных водорослей:

1. Раннее использование в качестве корма. Влияние гетеротрофного роста на питательную ценность водорослей неизвестно. Однако стоит попытаться получить культуру гетеротрофных штаммов, которые обычно используются в качестве корма и производятся фотосинтетически;

2. Накопление жиров. Накопление жиров (скорее, чем углеводов) в форме резервных запасов в условиях ограничения питательных веществ (обычно азота) может повысить питательную ценность корма для личинок рыб и моллюсков с высокими запросами калорий для роста;

3. Маленький размер. Коловратки с трудом переваривают частицы диаметром более 20 мкм. Личинки моллюсков и креветок предпочитают водоросли диаметром 10 мкм и менее;

4. Присутствие n-3 HUFA. Омега-3 полиненасыщенные жирные кислоты, особенно эйкозапентаевая и докозагексаеновая кислоты, считаются незаменимыми жирными кислотами для большинства морских рыб и моллюсков, и должны доставляться с пищей. Рацион, богатый ими, повышает скорость роста и выживаемость рыб и моллюсков;

5. Усвояемость. Коловратки способны переваривать водоросли с толстой клеточной стенкой, такие как Chlorella и Phaeodactylum. Однако моллюски и креветки с трудом переваривают такие клетки;

6. Пигментация. Фотосинтетические пигменты, особенно каротиноиды, придают окраску рыбе и креветкам.

В статье представлены результаты исследования “Raymond M. Gladue & John E. Maxey. Microalgal feeds for aquaculture. Journal of Applied Phycology 6: 131-141, 1994. 131”. Авторы работы определили водоросли, пригодные для гетеротрофного производства на аквакультурный корм. После скрининга большого числа видов водорослей на предмет гетеротрофного питания и потенциальной эффективности использования в качестве корма было выбрано 5 штаммов. Они росли гетеротрофно во встряхиваемых колбах и ферментерах на различных средах и в различных условиях.

Материалы и методы

Все водоросли, используемые в исследовании, получены из коллекции микроводорослей корпорации «Martek Bioscience». Способность к гетеротрофному питанию проверялась у следующих родов: Chaetoceros (3 штамма), Chlorella (10 штаммов), Chroomonas (1 штамм), Cryptomonas (3 штамма), Dunaliella (16 штаммов), Isochrysis (4 штамма), Nannochloris (2 штамма), Nannochloropsis (12 штаммов), Pavlova (2 штамма), Phaeodactylum (3 штамма), Skeletonema (1 штамм), Tetraselmis (62 штамма), Thalassiosira (2 штамма). Ряд водорослевых штаммов, которые согласно докладу растут гетеротрофно, также исследовался. Эта группа включала роды Chlamydomonas, Crypthecodinium, Cyelotella, Euglena, Ochromonas, Poterioochromonas, Nitzschia.

Компоненты для среды роста от Sigma. Морская вода от Instant Ocean.

Скрининг на гетеротрофность

Некоторые водоросли способны к гетеротрофному питанию только в узком диапазоне условий. Им может потребоваться высокая концентрация углерода или добавление источника неорганических нутриентов. Невозможно доказать, что водоросли неспособны к гетеротрофному питанию, так как невозможно быть уверенным в том, что культуральные условия точно соответствуют запросам водоросли для роста в темноте. Однако в рамках статьи определяются гетеротрофные водоросли, пригодные для развития в ферментере. Затемнение необходимо лишь для проверки роста на сравнительно дешевых средах. Различные комбинации сред характеризовались присутствием недорогого источника углерода, смеси источников неорганического и органического азота.

Сетка компонентов сред создана с целью получения гетеротрофного роста при минимальной определяемой среде, а также максимально концентрированной среде. Источник углерода вводился на низком (10-25 мМ) или высоком уровнях (100-250 мМ) с/без добавления сложных источников азота, витаминов и минералов. В качестве контроля, каждый штамм водоросли развивался в базовой фотосинтетической искусственной среде, которая включала неорганические соли и витамины, но не имела источника органического углерода. Для проверки гетеротрофности в эту основную среду вносился один или более источников углерода, в присутствии или отсутствии раствора сложного азота. Культуры росли в объемах 5 мл в 16х200 мм пробирках с завинчивающейся крышкой при 20°C и 25°C (±1°C). Каждый тест состоял из автотрофного контроля (основную среду инкубировали на свету при 40-100 мкмоль фотонов/м2*сек), негативного контроля (основную среду инкубировали в темноте) и нескольких комбинаций основной среды с добавлением нутриентов, инкубируемых в темноте (гетеротрофное питание) или на свету (миксотрофное).

Эти три среды в дальнейшем были разделены каждая на четыре рецепта: 1A, 1B, 1C, 1D. Процедура проведена для того, чтобы убедиться в развитии водорослей при высокой и низкой концентрации углерода, в присутствии или отсутствии дополнительных нутриентов.

Каждый штамм водоросли вначале испытывался в среде, содержащей высокий уровень органического углерода с введением сложных нутриентов (1A, 2A, 3A). Высокие значения нутриентов необходимы для достижения высокой плотности биомассы и, соответственно, экономической выгоды от использования ферментера. Те штаммы, которые отказались развиваться в среде с высоким содержанием углерода/нутриентов, затем испытывались в среде содержанием углерода (1B, 2B, 3B) и двух типах сред с низким содержанием углерода (1C, 2C, 3C, 1D, 2D, 3D). Гетеротрофный рост в среде с низким содержанием нутриентов, но не высоком содержании нутриентов, затем был взят на заметку как потенциально сложный штамм для масштабного выращивания.

Оценка роста в каждой тестовой пробирке проводилась с помощью макро- и микроскопических исследований.

Каждая культура обозначалась положительной или отрицательной по росту после сравнения плотности между опытной пробиркой, автотрофным и негативным контролем. Каждый тест повторялся с использованием миксотрофной контрольной пробирки для инокуляции свежего набора пробирок. Эта стратегия позволила водорослевым клеткам адаптироваться к среде за 1-2 неделе перед повторением теста.

Культура водорослей во встряхиваемой среде росла на вращающейся платформе шейкера, совершая 100-120 оборотов в минуту, при температуре 26°C в инкубаторе. Только те водоросли, которые хорошо росли в темноте, помещались во встряхиваемые пробирки. Размер водорослевых клеток определялся микроскопически под окуляром микроскопа.

Содержимое пробирок собирали центрифугированием в IEC клинической центрифуге. Гранулы ресуспендировали и промывались однократно изотоническим раствором искусственной морской соли. После раздавливания клеток во Французском клеточном прессе, гранулы замораживались-высушивались и хранились при температуре -20°C для анализа. Скорость роста определялась в пробирках и в ферментере путем ежедневного подсчета клеток и измерения сухой массы. Сухая масса использовалась для подсчета времени генерации по формуле:

T, генерации = (T*ln2)/(lnXt-lnX0), где T = время, пройденное между забором образцов, Xt = плотность сухой массы во время T, X0 = плотность сухой массы в нулевое время.

Ограничение азота в культуре водорослей достигалось выращиванием их в серии пробирок, содержащих градиент концентрации источника азота, необходимого для роста. Те культуры, биомасса которых снижалась со снижением концентрации азота, были лимитированы азотом.

Культуры в ферментерах росли в 3-литровых (2 литра рабочий объем) стеклянных ферментерах Applikon с мониторингом pH (Cole-Parmer model #5997-30 с позолоченным стирилизованным паром pH-зондом) и O2 (LH-Fermentation Level 2 Controller с позолоченным полярографическим зондом). Температура контролировалась на уровне 26°C с помощью Neslab рециркуляционной водяной бани. Автоматический контроль pH между 7.5-8.0 осуществлялся добавлением кислоты (1Н H2SO4) или основания (1Н NaOH), согласно показаниям pH-контроллера. Концентрация растворенного O2 поддерживалась на уровне 20% выше, чем в воде (аэрация и перемешивание). Асептические (загрязненные) образцы удалялись ежедневно для анализа.

Биохимический анализ

Углеводы определялись с использованием фенола и серной кислоты и глюкозы в качестве стандарта. Измерение абсорбции для белков и углеводов производилось на Shimadzu УФ-спектрофотометре (модель #UV-160). Содержание жирных кислот и профили определялись с помощью газовой хроматографии (Shimadzu модель GC-9A с Supelco SP2330 колонами) после формирования метоловых эфиров жирных кислот. Эфиры образовывались с помощью реагента преэфтрификации – метанольного основания Supelco. Идентификация отдельных жирных кислот производилась сравнением времени удержания со стандартом Nu-Chek Prep., а количество путем интеграции области пиков и сравнения с областью пиков внутреннего стандарта (пентановая кислота). Уровень n-3 HUFA является суммой DHA + EPA.

Результаты

Из 121 проверенного штамма, 57 – положительные на гетеротрофный рост. Они включают 44 Tetraselmis, 6 Chlorella, 4 Nannochloropsis и 3 Dunaliella. Внутри родов Chaetoceros, Cryptomonas, Isochrysis, Nannochloris, Pavlova, Phaedactylum, Skeletonema или Thalassiosira. Несколько штаммов не росли ни при каких условиях в лаборатории и не проверялись на гетеротрофность. К их числу относятся Chaetoceros gracillis, Chroomonas diplococcal, Cryptomonas ovate, Dunaliella bardawil, Pavlova gyrans и 4 штамма Tetraselmis. Большинство видов, позитивных на гетеротрофность, могли потреблять глюкозу в качестве источника углерода или расти в присутствии сложных нутриентов (вытяжки дрожжей и триптон). Очень немногие водоросли росли гетеротрофно на глицерине или органических кислотах в качестве источника углерода. Интересна изменчивость внутри каждого рода в отношении их способности расти в темноте при заданных условиях; каждый из 4-х родов с гетеротрофным штаммом также содержал штаммы, которые стремились к росту в темноте.

Все эти гетеротрофные водорослевые штаммы изучались для дальнейшего развития в зависимости от того, насколько они отвечали критериям.

Время генерации в ходе логарифмической фазы и n-3 HUFA содержание позволило выбрать водоросли для встряхиваемых пробирок и масштабного культивирования в ферментере. Штаммы Cyclotella, Nitzshia и Tetraselmis были единственными, которые быстро росли в темноте и содержали n-3 HUFA. К сожалению, ни один из четырех штаммов Nannochloropsis (предпочтительный корм для коловраток) не рос хорошо в гетеротрофных условиях встряхиваемых пробирок. Штаммы Chlorella имели высокую скорость роста (один штамм Chlorella vulgaris 3010 – очень высокую скорость генерации

На рисунке 1 изображен график влияния лимитирования азота на состав жиров и углеводов у 7 водорослей, которые предполагаются в качестве корма. Только Chlorella pyrenoidosa 3007 и Nitzshia alba 4008 способны нкапливать значительное количество жиров в биомассе. N. alba, в частности, показала свое значение как высокоэнергетический корм, потому что накапливает около 50% от своей биомассы в форме жира. С другой стороны, большинство гетеротрофных водорослей накапливают значительное количество углеводов, в независимости от уровня азота. Подобный механизм может быть обусловлен захватом чрезмерного количества глюкозы из среды и перевода его в крахмал.

На рисунке 2 изображено влияние режима роста (гетеротрофный против фотосинтетического) на содержание углеводов и жиров нескольких штаммов Tetraselmis. Все штаммы накапливали больше углеводов, когда развивались в темноте, и больше жиров, когда на свету. Большинство из них также имело более высокий уровень n-3 HUFA, когда развивались на свету (Рисунок 3). К сожалению, все штаммы Tetraselmis имели низкое содержание n-3 HUFA по сравнению с Nannochloropsis oculata, Nitzshia alba или Cyclotella cryptica.

После идентификации большого количества водорослей, способных расти гетеротрофно, следующим шагом стало определение нескольких (10 и менее) штаммов, обладающих высоким потенциалом для промышленного культивирования на аквакультурный корм. Особый акцент сделан на быстрый рост в гетеротрофных условиях. Медленнорастущие гетеротрофные водоросли иногда ускорялись со сменой условий культивирования и нутриентов или мутаций и отбора на более быстрый рост. Однако такие программы могут занять уйму времени. В работе сконцентрировались на быстрорастущих штаммах (время генерации менее 12 часов). Пять штаммов водорослей оценены, как наиболее многообещающие для питания коловраток:

1. Tetraselmis 3091, T. suecica 30112 и T. verrucosa 30115. Род зеленых водорослей Tetraselmis описан как отличный корм для коловраток. Эти штаммы все имели чрезвычайно высокую скорость роста (время генерации 9-12 часов в логарифмической фазе), и все три содержали n-3 HUFA (хотя и в небольших количествах);

2. Chlorella vulgaris 3010. Эта пресноводная зеленая водоросль способна чрезвычайно быстро расти в среде с морской водой. В отличие от других пресноводных водорослей, она не испытывает осмотический стресс и не лизируется в морской воде. Время генерации 6.5 часов. Так как водоросль не содержит n-3 HUFA, кормление его потребует добавки других водорослей или морских жиров с омега-дрожжами;

3. Cyclotella cryptic 40172. Диатомовая водоросль с высоким содержанием n-3 HUFA, EPA (14-21% от всех жирных кислот и около 2% от сухой биомассы). Штамм имеет относительно низкую скорость роста (время генерации 12 часов в логарифмической фазе). Он содержит максимальную для гетеротрофных водорослей концентрацию n-3 HUFA. Кроме того, предыдущие успехи с культивированием в ферментере другой диатомовой – N.alba, способствовали включению штамма в эксперименты с ферментером.

На иллюстрации 4 изображена кривая роста биомассы для 5 водорослей в ферментере. Nitzshia alba 4008 включен в качестве эталона для сравнения с другими водорослями.

Продуктивность биомассы и плотность N. alba намного превосходила другие 5 штаммов. Однако условия культивирования для неё были лучше оптимизированы, потому что авторы несколько лет работали с этой диатомовой водорослью. Изначально, попытки культивировать N. alba давали такие же результаты, что и с нынешними диатомовыми , C. cryptic. Предполагается, что оптимизация физических и химических условий культивирования существенно улучшит продуктивность 5 штаммов.

Обсуждение

Большинство исследованных гетеротрофных водорослей способны использовать глюкозу в качестве источника углерода (52 из 57 гетеротрофных штамма). Относительно немногие использовали глицерол (14 штаммов) или органические кислоты (15 штаммов). Хотя гетеротрофные водоросли, исследуемые в работе, представляли 7 различных классов, неутешительно немногие из них являются хорошим кормом для личинок. Как ожидалось, многие штаммы из рода Chlorella и Tetraselmis способны к гетеротрофному питанию, но, к сожалению, ни один из штаммов Chaetoceros, Isochysis, Skeletonema или Thalassiosira не имел таких свойств. Четыре штамма гетеротрофных водорослей Nannochloropsis развивались слишком медленно для промышленного культивирования.

Готовые аквакультурные корма из водорослей, большинство из которых выращиваются фотосинтетически в прудах, доступны из немногих независимых источников. Эти корма включают сине-зеленую водоросль Spirulina (продается по 30$/кг от сухой массы, Ocean Star International Marine Lab, Inc., and Argent Chemical Laboratories, США) и пресноводная Chlorella (продается по 192$/кг, Nisshin Finechemical Co, Япония). Из-за цены обе водоросли имеют ограниченную ценность как источник корма. Nisshin также продает великолепный корм для коловраток, переваренных Nannochloropsis. Однако у них заоблачная цена (2000$/кг сухой массы).

Вплоть до момента ухода из бизнеса, в 1991 году, компания CellSysytems продавала спрей с высушенными Tetraselmis suecica и Cyclotella cryptic для аквакультуры по 170$/кг сухой массы. Эти продукты были первой попыткой обеспечить гетеротрофный рост и приготовление сухих водорослей. Однако высокая стоимость ограничивала повсеместное использование.

Идеальный корм для личинок должен быть недорогим, питательным, легким в приготовлении, иметь долгий срок хранения. Несколько компаний, производящих корм, работают над обеспечением заменителей водорослей и коловраток с озвученными качествами.

Примерами заменителей являются корм для мальков Kyowa A-250 (микрокорм 180$/кг, Япония) и HathcFry Encapsulation (микро инкапсулированный корм за 40$/кг, США). Значительные успехи достигнуты в разработке и использовании этих кормов, особенно в выращивании личинок креветок Penaeidea. Тем не менее, многие хозяйства продолжают использовать водоросли для кормления личинок морских моллюсков, рыбы, креветок. Успешное внедрение гетеротрофной культуры водорослей или искусственного корма будет зависеть от того, насколько тот или ной продукт удовлетворяет требованиям, заявленным выше.

Пиковый прирост биомассы N. alba составляет 20 г/л в день. Это очень много для водоросли и позволяет добиться стоимости производства 12$/кг сухой массы (оценка для стоимости ферментации). С другой стороны, прирост биомассы для других пяти штаммов варьирует от 0.4 для Cyclotella, до 0.9 для всех трех штаммов Tetraselmis и 1.6 для Chlorella. Оценочная стоимость также варьирует от 160$/кг для Chlorella, до 600$/кг для Cyclotella. Очевидно, для экономически прибыльного предприятия необходима дальнейшая оптимизация протоколов.

Эксперименты в ферментере показали пригодность 5 штаммов для масштабного культивирования в ферментере, когда на 1 литр среды приходится несколько граммов от сухой массы водорослей (это гораздо больше, чем при фотосинтетическом росте). Все штаммы выдерживают силы вращения при низких и умеренных скоростях (RPM), образуют мало пены, не самоингибируются и не требуют много кислорода.

Однако перед осуществлением исследований, для оптимизации протокола культивирования, необходимо определить питательную ценность этих водорослей. Многие из предложенных в работе гетеротрофных штаммов не проверяли в качестве корма. Авторы инициировали два эксперимента с кормлением: на американских устрицах (Crassostrea virginica) и с коловратками Brachionus plicatilis. Результаты указывают на то, что вид N. alba эффективен для кормления устриц, но не коловраток. Tetraselmis, Chorella и Cyclotella применимы для обоих организмов.
——
Raymond M. Gladue, John E. Maxey.Microalgal feeds for aquaculture. Journal of Applied Phycology. 6 (2): 131–141, 1994