Нильская тиляпия Oreochromis niloticus (Linnaeus, 1758) является одним из наиболее значимых объектов рыбоводства (FAO, 2005; Nonglak et al., 2012). В коммерческом секторе нагул тиляпии до рыночного размера главная проблема. Рыба начинает размножаться в пруду, вызывая укрупнение популяции и повышая разброс особей по размеру и массе (Mair et al., 1997; Jiménez & Arredondo, 2000; Tariq-Ezaz et al., 2004). Кроме того, самки растут медленнее самцов и позже достигают рыночного размера. Однако рыбоводы, к моменту сбора, стремятся получить рыбу одного размера, поэтому уже на протяжении многих лет выращивание односамцовых популяций является эффективной и востребованной технологией (Vera-Cruz et al., 1996; Mair et al., 1997; Jiménez & Arredondo, 2000; Müller & Hörstgen, 2007).

Чаще всего для смены пола используется гормональная обработка. Однако этот метод подвергается критике. Накопление гормонов в окружающей среде, и возрастание числа потребителей, которые не желают питаться обработанной рыбой (Piferrer, 2001; Müller & Hörstgen, 2007; Leet et al., 2011), заставляют искать альтернативные технологии трансформации пола. Одной из них является получение генетических самцов тиляпии (GMT) за счет скрещивания YY-самцов с XX-самками (Vera-Cruz et al., 1996; Mair et al., 1997).

О генотипе YY

Существование самцов, гомозиготных по Y хромосоме, отмечено в 1958 году у медаки (Oryzias latipes). Японский исследователь Ямамото получил YY супер-самцов, используя гормоны и селективное скрещивание. Позднее, YY-особи были получены у гуппи (Poecilia reticulate, Yamamoto, 1963), золотой рыбки (Carassius auratus, Yamamoto, 1975) и тиляпии (Oreochromis niloticus и O.mossambicus, Varadaraj & Pandian, 1989).

Опубликовано несколько работ с YY-самцами различных видов, хотя их выживаемость очень низкая. Например, супер-самцы вида Salmo gairdneri доживают только до стадии появления «глаза» в икринке (Johnstone et al., 1979). Таким образом, возможность получить жизнеспособных самцов лосося с таким генотипом спорна (Calhoun & Shelton, 1983). В своей статье, Pandian и Sheela (1995) заключили, что наличие более одной Y-хромосомы в генотипе самца или самки снижает их жизнеспособность. Однако Mair с коллегами (1997) отмечал схожую с нормальными XY-самцами плодовитость и выживаемость супер-самцов нильской тиляпии (O. niloticus). Позднее, он продемонстрировал выгоду от выращивания в крупных масштабах односамцовых популяций. Для изменения пола исследователь использовал генетические манипуляции. Именно он впервые описал пошаговое руководство получения YY-самцов нильской тиляпии.

Технология

Технология получения YY-самцов тиляпии включает серии этапов феминизации с изучением потомства на расщепление по половой принадлежности. Программа получения YY-мужские особей вида O. niloticus предложена на основе активного изучения генетики половой детерминации у тиляпий. Работа проходила в Университетском колледже Уэльса (Суонси, Великобритания). Её результаты показали, что представители данного вида имеют преимущественно монофакториальную генотипическую систему с гетерогаметностью самцов (XY) и гомогаметностью самок (XX) (Penman et al., 1987; Mair et al., 1990).

Монофакториальный генотипический – находящийся под влиянием одного фактора — гена.

Эта монофакториальная гипотеза, однако, не объясняет некоторые расхождения от прогнозируемого соотношения полов. Возможно, это вызвано флуктуациями средовых факторов, например, температуры (Mair et al., 1990; Trombka & Avtalion, 1993). С другой стороны, влияние температуры на половую детерминацию не объясняет присутствие небольшого числа самцов в поколении предполагаемых самок, выращенных при нормальной температуре. Не исключено, что эти расхождения вызваны аутосомными или полифакториальными генетическими факторами.

Протокол Майера для получения супер-самцов тиляпии:

1. Феминизация потомства от скрещивания нормальных родителей (о гормонах написано ниже). На этапе феминизации пол мальков нельзя определить. Эта процедура успешно проводится с представителями вида O. niloticus и другими видами Oreochromis;
2. Определение трансформированных самок (XY) с помощью проверки её потомства. Так как морфологические, поведенческие особенности и особенности кариотипа этой самки не отличаются от её генетических сестер, остается лишь проверка по менделевскому расщеплению пола у следующего поколения. Для этого, самку скрещивают с нормальным самцом и наблюдают расщепление по полу 3:1 (1XX:2XY:1YY);
3. Скрещивают всех определенных в пункте 2 трансформированных самок (XY) с нормальными самцами (XY). В поколении у 25% особей получается интересный генотип – YY. От каждой самки (XY) получают потомство для дальнейшего исследования поколений;
4. Определение супер-самцов YY. Самцов (2XY и 1YY), полученных в пункте 2, скрещивают с нормальными самками (XX). Потомство от самцов (YY) будет состоять только из самцов. Хотя эта процедура позволяет определить особей с генотипом YY, она непрактична для крупного предприятия. Поэтому важно было, чтобы успешно завершились следующие этапы программы;
5. Проводится скрещивание самцов (YY) с ранее определенными самками (XY), полученными после обработки эстрогеном. Появляется поколение с двумя генотипами – XY и YY. Потомство делится на две группа, одна из которой подвергается феминизации;
6. Проводится проверка поколений для обработанных эстрогеном самок (XY и YY) и необработанных самцов (YY). Предполагается, что в отсутствии различий трансформации XY и YY генотипов, 50% всех трансформированных самок будут иметь генотип YY. Проверка поколений при скрещивании самок с нормальными самцами (XY) должна показать, что от самок (XY) появляются мальки с генотипами (1XX 2XY 1YY), т.е. три самца на одну самку, а от самок (YY) – появляются практически только самцы. На практике, сложно провести статистическое отличие полового состава потомков от этих контрольных скрещиваний. Для облегчения задачи нормальные самки (XX) подвергаются маскулинизации андрогенами и превращаются в самцов (XX). Скрещивание этих самцов с самками XY и YY дает расщепление признака 1:1 и 1:0, соответственно;
7. Для выращивания самцов (YY) в большом количестве, без необходимости проведения проверки поколений, необходимо изучить потомство от скрещивания самцов (YY) с самками (YY);
8. Скрещивание самцов (YY) с самками (YY) приводит к появлению только самцов (YY). Для создания будущего маточного стада необходима феминизация потомства (YY).

Методы феминизации

Легче всего изменить пол рыбок с помощью орального введения эстрогенов и андрогенов. На этапе половой дифференцировки, в течение 14 (Srisakultiew, 1993) — 30 (Alvendia — Casauay and Carino, 1988) дней после вылупления, в корм малькам добавляются гормоны. Кормление осуществляется четыре раза в день. Протокол феминизации оптимизирован группой исследователей, Rosenstein с Hulata (1994) и Mair с Santiago (1994). Он предполагает в течение 20 дней кормить мальков сухим кормом, содержащим 1000 мг/кг диэтилстильбэстрола (DES).

Сравнительно недавно была предложена феминизация выводка, состоящего из супер-самцов YY, под действием теплового шока. Выдерживание мальков (YY) в течение 21 дня при температуре 36ºC приводило к появлению 34% самок YY (32% после обработки DES) (Karayücel I. et al., 2003). Однако смертность была высокой (62.6% против 97%).

Другие протоколы феминизации представлены в таблице (Abdel-Fattah M. El-Sayed. Tilapia Culture):

Вид	Гормон	Введение	Доза	Время	Прод-ть	% самок
O.n	EE	ванна	170-200 мг/л	мальки	18 дней	100
	DES	корм	400	8.7 мм	28 дней	80
	EE		100	7-12 мм	40 дней	91
O.m	DES			10 dph	11 дней	100
	EE			на стадии желточного мешка	10 дней
	EE
	EE+methallib			мальки	42 дней	95
	EE		100-200		40 дней	93-98
O.s	EE		100	9 мм	42 дней	92

Виды: Oreochromis niloticus, O.mossambicus, O.spilurus. dph — дней после вылупления; EE — 17α-этинилэстрадиол; DES — диэтилстильбэстрола.

Для маскулинизации (Guerrero III and Guerrero 1988 и Vera Cruz and Mair 1994) рыбок кормят в течение 25 дней рационом, содержащим 17α-метилтестостерона. Затем молодь пересаживается для подращивания в садки.

Другие протоколы маскулинизации представлены в таблице (Abdel-Fattah M. El-Sayed. Tilapia Culture):

Вид	Гормон	Введение	Доза	Время	Прод-ть	% самцов	Ремарка
O.n	F	корм	200-500	7 dph	30 дней	92.5-96	генетические самки
	F	корм	75-100	мальки		100
	ET	корм	60	мальки	25-28 дней	91-99.4
	MT	корм	30	мальки	21 день	99
	MT	корм	60	10.4 мм	14-28 дней	82-92
	TBA	ванны	250 мг/л	10 dpf	2 часа	98-100	2 часа обработки ультразвуком
	AN	ванны	100-250 мг/л			92
	MT	ванны	50 мг/л			98
	MDHT	ванны	250 мг/л			98-100
	MT	корм	60		10-30 dpf	92
	MT	ванны	500 мг/л	10 и 13 dpf	3 часаа	87
	MDHT	ванны				83-100
	MDHT	ванны	1800 мг/л	14 dpf	4 часа	100	одно погружение
	MT	ванны		10 и 14 dpf		98.3	два погружения
	ET	ванны		14 dpf		86.7
O.m	MDHT	ванны	5-10 мг/л	10 dpf	10 дней	100
	MT	корм	30		18 дней	98
	ET	корм	60	9-11 dpf		100
O.a	MI	ванны	0.6 млн-1	9-11 мм	35 дней	82
	MT	корм	50	9 мм	42 дня	100
	ET	корм	60	мальки	25-28 дней	83-97
	TBA	корм	25	9.1 мм	28 дней	98.3
O.s	MT	корм	70	мальки	38 дней	90
	MT	ванны	2.5 млн-1	личинки на стадии желточного мешка	4 дня	100	В солоноватой воде, затем в корм добавлялось 50 мг/кг MT
красная тиляпия	11β-OHA4	корм	50	10 dpf	28 дней	99.1
O.n * O.a	тамоксифен	корм	100	9 мм	42 дня	100
O.n * O.a	ET	корм	60	мальки	25-28 дней	96-100

Виды: Oreochromis niloticus, O.mossambicus, O.aureus, O.spilurus. dpf — дней после оплодотворения; dph — дней после вылупления; F — фадразол; ET — 17α-этинилтестостерон; MT — 17α-метинилтестостерон; TBA — тренболон ацетат; AN — андростендион; MDHT — 17α-метилдегидротестостерон; MI — метилизотиазолинон; 11β-OHA4 — 11β-гидроксиандростенедион; тамоксифен

Техника проведения проверки поколений

Для проведения этого теста половозрелых тиляпий (150-200 дней) сажают на нерест в садки площадью 1 м², погруженные в земляные пруды глубиной 60 см. Посадка осуществляется парами, либо по три самки на одного самца. Садки проверяются каждые 7 дней, икра и мальки собираются у инкубирующих самок. Затем самцы и самки родители маркируются пассивными интегрированными ретрансляторами (метки Passive Integrated Transponder) и помещаются в общий бетонный бассейн. Икринки и мальки инкубируются искусственно до момента, пока у них не рассосется желточный мешок. Затем они помещаются группами от одного родителя в садки с мелкой сеткой. Потомство выращивается примерно три месяца, пока они не достигнут массы 3 грамма. После этого их умерщвляют и по осмотру гонад определяют пол (техника размягчения Guerrero and Shelton, 1974. Описание метода — https://om.ciheam.org/om/pdf/b63/00800919.pdf https://www.scielo.br/pdf/cr/v32n1/a23v32n1.pdf ). В больших выводках необязательно умерщвлять всех особей. Достаточно взять наугад 100 особей, избегая предвзятости в выборе по размеру.

На фотографиях снизу представлена ткань семенников и яичников мальков в возрасте 20-60 дней после вылупления. Масса рыбок 0.25-2.0 грамма, длина 26-53 мм. Половую принадлежность уже можно диагностировать.

Особенности половой системы супер-самцов (YY)

Специалисты из Филиппин провели сравнение развития половой системы самцов тиляпий, имеющих нормальный гетерозиготный генотип (XY) и гомозитный (YY). В работе использовались нильские тиляпии вариации Египет-Суонси, полученные в программе «Исследования генетики рыб». Особи выращивалась в Центре Пресноводной аквакультуры государственного университета Центрального Лусона (провинция Нуэва-Эсиха, Филиппины). Анализ тканей проводился в Исследовательском институте естественных наук, Университет Филиппинс, (город Кесон-Сити, Филиппины).

В ходе развития примордиальные (зачаточные) герминальные клетки развивались у обоих типов самцов в одно время, т.е. к 8 дню после вылупления. Эти клетки были крупнее у YY-особей (1.85 против 0.9 мк) и к 9-22 дню закладывали зачатки гонад. У YY-самцов раньше формировались семенниковые доли, к 15 дню. Росток (бластема) половых путей появлялся у YY-особей к 23 дню, а у XY-особей к 27 дню. К 79 дню у обеих групп отмечалось множество делящихся мейозом клеток. К 95 дню полностью дифференцированные семенники YY-самцов содержали зрелые сперматозоиды, тогда как у XY-самцов созревание длилось 105 дней. Супер-самцы имели более крупные семенники, с более толстой соматической тканью, больше сперматогенных клеток, и их половая система развивалась раньше. Размер герминальных клеток и размер их ядра не отличались у обоих типов самцов.

<hr />

<span style=»color: #808080;»>Статья проверена 1 читателем (19.02.2017)</span>

<hr />

——
https://fishgen.com/YYSEXDET-CJF1.PDF
https://ag.arizona.edu/oip/ista6/ista6web/pdf/104.pdf

[user]Food and Agriculture Organization (FAO). 2005. Cultured aquatic species information program. Oreochromis niloticus. Text by Rakocy, J.E. In: FAO Fisheries and Aquaculture Department. Rome. [https://www.fao.org/fishery/culturedspecies/Oreochro mis_niloticus/en]. Reviewed: 18 September 2013.
Nonglak, P., S. Boonanuntanasarn, A. Jangprai, G. Yoshizaki & U. Na-Nakorn. 2012. Pubertal effects of 17?-methyltestosterone on GH-IGF-related genes of the hypothalamic-pituitary-liver-gonadal axis and other biological parameters in male, female and sexreversed Nile tilapia. Gen. Comp. Endocr., 177: 278- 292.
Mair, G.C., J.S. Abucay, O.F. Skibinski, T.A. Abella & J.A. Beardmore. 1997. Genetic manipulation of sex ratio for the large scale production of all-male tilapia Oreochromis niloticus L. Can. J. Fish. Aquat. Sci., 54: 396-404.
Mair, G.G., J.A. Beardmore & D.O.F. Skibinski, 1990. Experimental evidence for environmental sex determination in Oreochromis species. In: R. Hirano & I. Hanyu (eds). The second Asian fisheries forum. Manila, Philippines, Asian Fisheries Society: 555-558
Mair, G.C. and Santiago, L.P . 1994. Feminization of Nile tilapia Oreochromis niloticus (L.) by oral application of Diethylstilbestrol (DES). In The Third Asian Fisheries Forum. Edited by L. M. Chou, A. D. Munro, T. J. Lam, T. W. Chen, L. K. K. Cheong, J. K. Ding, K. K. Hooi, H. W. Khoo, V. P. E. Phang, K. F. Shim and C. H. Tan. Asian Fisheries Society, Manila, Philippines. pp. 94 — 97
Jimenez, B.M.L. & F.J.L. Arredondo. 2000. Manual tecnico para la reversion sexual de tilapia. UAMIztapalapa, Mexico, D.F., 36 pp.
Tariq-Ezaz, M., J. Myers, S. Powell, B. McAndrew & D. Penman. 2004. Sex ratios in the progeny of androgenetic and gynogenetic YY male Nile tilapia, Oreochromis niloticus L. Aquaculture, 232: 205-214.
Vera-Cruz, M.E., C.G. Mair & P.R. Marino. 1996. Feminization of genotypically YY Nile tilapia Oreochromis niloticus L. Asian Fish. Sci., 9: 161-167.
Muller, B.A. & S.G. Horstgen. 2007. A YY-male Oreochromis niloticus strain developed from an exceptional mitotic gynogenetic male and growth performance testing of genetically all-male progenies. Aquacult. Res., 38: 773-775.
Piferrer, F. 2001. Endocrine sex control strategies for the feminization of teleost fish. Aquaculture, 197: 229- 281.
Leet, K.J., E.H. Gall & S.M. Sepulveda. 2011. A review of studies on androgen and estrogen exposure in fish early life stages: effects on gene and hormonal control of sexual differentiation. J. Appl. Toxicol., 31: 379- 398.
Johnstone, R., T.H. Simpson & H.F. Youngson, 1979. Sex reversal in salmonid culture. Aquaculture. 13: 115- 134.
Calhoun, W.E. & W.L. Shelton., 1983. Sex ratios from spawnings of sex-reversed broodstock of Tilapia nilotica. Aquaculture. 33: 365-371.
Pandian, T.J. & S.G. Sheela, 1995. Hormonal induction on sex reversal in fish. Aquaculture. 138: 1-22.
Penman, D.J., M.S. Shah, J.A. Beardmore & D.O.F. Skibinski, 1987. Sex ratios of gynogenetic and triploid tilapia. Proc. World on Selection, Hybridization and Genetic Engineering in Aquaculture. 2:267-276
Trombka, D. & R.R. Avtalion, 1993. Sex determination in tilapia. A review. Isr. J. Aquacult. Bamidgeh 45: 26-37.
Srisakultiew, P. 1993. Studies on the reproductive biology of Oreochromis niloticus L. Ph.D. thesis, University of Stirling. 310 p
Alvendia — Casauay, A. and Carino, V. S. 1988. Gonadal sex differentiation in Oreochromis niloticus. In : ICLARM Conference Proceedings, 15: The Second International Symposium on Tilapia in Aquaculture. Edited by R. S. V. Pullin, T. Bhukaswan , K. Tonguthai, and J. L. Maclean. Department of Fisheries, Thailand and International Center for Living Aquatic Resources Management, Bangkok, Thailand and Manila, Philippines. pp. 121 — 124
Rosenstein, S., and Hulata, G. 1994. Sex reversal in the genus Oreochromis: Optimization of feminization protocol. Aquacult. Fish. Manage. 25: 329 — 339.
Guerrero III, R. D., and Guerrero, L. A. 1988. Feasibility of commercial production of sex — reversed Nile tilapia fingerlings in the Philippines. In: ICLARM Conference Proceedings, 15: The Second International Symposium on Tilapia in Aquaculture. Edited by R. S. V. Pullin, T. Bhukaswan, K. Tonguthai, and J. L. Maclean. Department of Fisheries, Thailand and International Center for Living Aquatic Resources Management, Bangkok, Thailand and Manila, Philippines. pp. 183 — 186.
Guerrero III, R. D. and Shelton, W. L. 1974. An aceto-carmine squash method of sexing juvenile fishes. Prog. Fish Cult. 36: 56.
Vera Cruz, E. M., and Mair, G. C. 1994. Conditions for effective androgen sex reversal in Oreochromis niloticus (L.). Aquaculture. 122: 237 — 248.
Karayücel, I., Penman, D., Karayücel, S., & McAndrew, B. (2003). Thermal And Hormonal Feminization Of All Male YY Nile Tilapia, Oreochromis Niloticus L.. The Israeli Journal of Aquaculture — Bamidgeh, 55(2), 114-122.

[/user]