В данной работе мы исследовали два вида, которые принадлежат к двум филогенетически обособленным семействам костных рыб (Цихлиды и Циприниды) и, которые имеют как глоточные зубы и зубы ротовой полости (Цихлиды), так и только глоточные зубы (Циприниды). Мы продемонстрировали, что развитие зубов in vivo может быть воспроизведено in vitro у обоих видов, когда любые головные экспланты личинок или челюсти, изолированные от взрослых инкубировались ряд дней в среде определенного химического состава.

Инициация зубов in vitro

Наши эксперименты показывают, что зубной зачаток может быть инициирован в условиях, используемых в нашей культуре in vitro (как в случае эксплантов Hemichromis 120 часов пеостэмбрионального развития, так и в случае Danio эксплантов 45 часов). Доклады в литературе о возможности развития зубных зачатков у позвоночных являются в какой-то степени противоречивыми. Противоположные результаты могут объясняться разными условиями культивирования. Например, окуло- имплантация в лишенные зубов нижние челюсти мышей приводит к массе зубов, не смотря на то, что зубная пластинка отсутствует в начале эксперимента (Лумсден 1979; Лумсден и Бюхенен 1986). Зубы мыши могли инициироваться in vitro в бессывороточной среде с ростовыми факторами, даже когда зубная пластинка не присутствовала в начале экспериментов (Чай и др. 1998; Амано и др. 1999). В противоположность этому, Фергюсон и др. (1983) не смогли получить любые структуры зуба на культивируемой нижней челюсти Alligator mississippiensis (как в бессывороточной, так и сывороточнй среде), когда эксплантация проходила до момента дифференцировки и до момента присутствия зубных рудиментов. По нашим данным, это является первым докладом, касающимся инициации in vitro зубов костных рыб.

У мышей, чрезмерное количество ретинола и ретиналя приводило к инициированию сверхкомплектных зубных зачатков в диастемальной зубной пластинке in vitro (Кронмиллер и др., 1994, 1995). Другие факторы, такие как эпидермальный фактор роста, давал результаты совместно с присутствием ретинола и ретиналя (Кронмиллер и др., 1995). Добавление ретиноловой кислоты в среду культивирования не изменяло на расположение зубов, наблюдающееся на 48 часу постэмбрионального развития, 72 часу постэмбрионального развития и 10 днях постэмбрионального развития у головных эксплантов Данио рерио (K. Ван дер хейден и др., неопубликованные данные). Фактор роста нервов обязательно добавлялся в среду для инициирования и морфогенеза зубов мыши (Амано и др., 1999). Удивительно то, что по заявлениям иннервация играет роль в инициировании зубов мыши (Люмсден и Бюхенен, 1986). У костных рыб инициирование смены зубов задерживается в денервированной нижней челюсти взрослой особи цихлиды Tilapia mariae (Туйску и Хилденбранд, 1994); иннервация, кроме того, рассматривается как необходимое условие для процесса смены зубов.

Коуменс и Сайр (1996) наблюдали развитие зубных зачатков цихлиды в бессывороточной среде, но не были уверены инициировались ли данные зубные зачатки на момент экспланации. Наши данные подтверждают формирование in vitro зубных зачатков. В противоположность этому, не инициировалось зубных зачатков в головных эксплантах личинок оризии и Данио рерио в содержащей сыворотку среде (Мияке и Хейл, 1994). Возможным объяснением этих противоположных результатов является любой неблагоприятный фактор среды, либо отсутствие важных компонентов, таких как, дексаметазон, синтетических глюкокортикоидов, известных своим позитивным эффектом на дифференцировку эрителия (Симо и др., 1992).

Так как эксплантировались не полные (Hemichromis) или целые головы (Данио), мы не можем игнорировать возможное действие эндогенных веществ, таких как, определенные ростовые факторы или возможный эффект присутствующих нервов. Однако, данные влияния снижаются в отсутствии тока крови в культуре и перерезками черепным нервов, вызванных декапитацией. Мы не можем, тем не менее, исключать, что  различные ткани, присутствующие в эксплантах могли быть источником паракринных факторов, которые вероятно могли стимулировать развитие новых зачатков. В отношении избегания нежеланных воздействий со стороны остатков эндогенных веществ, эксплантация изолированных челюстей является более привлекательной, чем эксплантация целых голов. Однако, для отделения челюстей требуется вырезать ткань во многих местах и, оставлять маленькие участки материала, что сложно при удалении чрезвычайно мелких челюстей личинок рыб, ткань может легко повредиться.

До настоящего времени мы не знали точного времени, за которое эпителий глотки и ротовой полости связан с однонтогенным процессом, равно как, неизвестным было время, когда эктомезенхима готова отвечать. Если имеется фаза, в которую вовлекается эпителий, но не проявляются морфогенетические сигналы формирования зубов, инициирование новых зачатков не является сюрпризом и может быть атрибутом промежутка времени между «молекулярной инициацией» и «морфологической инициацией». В недавнем исследовании Лауренти и др. (2004) показали, что у Данио рерио, прыгающий ген evel экспрессировал в области плакоды зубной зачаток в положении 4V, но не в 3V и 5V. Однако, инициирование места экспрессии могло быть достаточно для покрытия также и областей 3V и 5V. Если место экспрессии связанное с 4V компенсирует способность зоны, которая также покрывает 3V и 5V в эксплантах, у которых данные зачатки ещё не присутствуют морфологически. В экспериментах, проведенных на Данио рерио, с эксплантами младше, чем 45 часов постэмбрионального развития, исследованы могут ли все три зубных зачатка инициироваться прежде их морфологического появления, и если так, на каком этапе развития это возможно.

Вестергард (1983, 1988) и Вестергард и Фергюсон (1986, 1987) предложили гипотезу, по которой инициирование зубов связано с развитием челюсти (поддерживающая кость), таким образом, подразумевается, что зачатки не дифференцируются пока они не получат некоторый сигнал, то есть, челюсти выросли настолько большие, что они достаточны для развития нового зачатка. В нашей in vitro культуре, зубы инициировались вместе с развитием хрящевых жаберных рогов и их перихондральной костью, что свидетельствует о некоторой взаимосвязи между инициированием зубов и развитием челюсти. Шиллинг и др. (1996), однако, докладывали о присутствии зубов у Данио рерио, принадлежащих к группе плоскоголовых мутантов с недостатком хрящевых пятых жаберных рогов, что, таким образом, приводит серьезный аргумент против взгляда Вестергарда и Фергюсона (1986, 1987). Подобным образом, в некоторых экспериментах на эмбрионах амфибий проводилось развитие зубов в отсутствии поддерживающей кости (Сигнорет 1960).

От морфогенеза до прикрепления

Большинство исследований in vitro мышиных зубов касается эксплантов, содержащих зубные рудименты, таким образом, фокусируется преимущественно на этапах морфогенеза и дифференцировки (Кох 1967; Сакакура 1986; Марк и др. 1992). При использовании телячьей сыворотки и, так называемого, флотационного метода, Сакакура (1986) провел нормальное пространственное развитие зачатков коренных зубов мыши до этапа появления верхушки. В нашей культуре форма (и размер и ориентация) зубов при дифференцировке in vitro проявлялось подобно тому как это проходит in vivo. Это подтверждалось при трехмерной реконструкции.

Марк и др. (1992) продемонстрировали, что экзогенные ретиноиды необходимы для морфогенеза коренных зубов мыши. В наших экспериментах, не смотря на отсутствие ретиноидов в среде, зубы подвергались нормальному морфогенезу. Мы полагаем, что любой эксплант содержит достаточное количество эндогенных ретиноидов, либо зубы рыб в своем развитии не нуждаются в данной молекуле.

Неожиданно, зубы 3V и 5V, в противоположность зубу 4V, запаздывали с прикреплением у эксплантов Данио рерио, не смотря на то, что имелось достаточно времени для этого in vitro. Одним из возможных объяснений является то, что задержка, наблюдаемая в культуре, прибавляется к общему времени и зубы, в конечном счете, прикрепляются. Наблюдалось, что в эксперименте, в котором 3V и 5V эксплантировались на этапе дифференцировки, они прикреплялись к жаберным рогам за счет неминерализированного соединения после 7 дней культивирования, что поддерживает данную гипотезу. В качестве альтернативы, определенные зубы с недостаточным анкилозом (хотя и через неминерализированную поддерживающую кость) могут вероятно также эксплантироваться к своему месту прикрепления in vivo. В самом деле, зуб в положении 4V является единственным зубом вентрального ряда прямо анкилозированным, и полностью анкилозированным, на перихондральной кости, окружающей пятым хрящом пятого жаберного рога. Предоставим основную задержку окостенения черепных костей в наших условиях культивирования, неудача с прикреплением 3V и 5V могла быть вызвана костной пластинкой, в которую данные зубы нормально прикрепляются, будучи не сильно развитыми, и место прикрепления не сильно изменялось. Это свидетельствует о том, что взаимодействие между клетками проходит на зубном фундаменте, то есть на поверхности поддерживающей кости. У H. bimaculatu прикрепление в основном проходило in vitro. In vivo зубы присоединялись к перихондральной кости через кольцевые воронки кости прикрепления (Хьюзейн и Сайр 1997). Данное различие в прикреплении in vivo между обоими видами может считаться за различие, наблюдаемое и in vitro.

Обнаружено, что в нашей культуре Данио, формируются как просвет глотки, так и крипты, но зуб 4V, не смотря на это, становится прикрепленным, что значительно ухудшает прорезывание. Это поддерживает наше ранее заключение (Хьюзейн и Сайр 2004), что формирование крипты является независимым процессом. Хорне-Бадовинач и др. (2001) докладывали о том, что формирование просвета в пищеварительном тракте Данио связано с кластеризацией сращенных объединений. Если такой процесс вызван формированием просвета и крипт, он действительно отличается от разрушения клеточных перемычек, происходящем при выступлении кончика зуба в крипте (Хьюзейн и Сайр 2004).

Ультраструктура развития зубов in vitro

Наши результаты просвечивающей электронной микроскопии для обоих видов рыб показывает сильную схожесть в структурных характеристиках клеток и матрице культивируемых зубов in vitro при сравнении с in vivo, за исключением недостатка минерализации. Эта «нормальность» культивирования зубов in vitro в достаточной степени показана присутствием эмалевого органа с дифференцированными амелобластами и внешним зубным эпителием, присутствием зубного бугорка с дифференцированными одонтобластами и природой отложения матрикса. Вкратце, фенотип, который мы наблюдали in vitro схож с таковым для in vivo, что также может быть оценино при сопоставлении с данными, опубликованными в отношении ультраструктурных деталей развития первого поколения зубов Хемихромиса (Хьюзейн и Сайр 1997) и Данио (Хьюзейн и др. 1998). Использование маркеров для идентификации структур, развивающихся in vitro как истинных зубов, по нашему мнению, были излишними. Более того, молекулярный анализ костных одонтобластов только недавно был введен и, таким образом, ещё нет доступных маркеров для идентификации зубных белков матрикса костных рыб. Дополнительно, возрастает количество фактов, что маркеры по общему мнению специфичны для зубной матрицы, экспрессирующейся в незубных структурах тетрапод (Ляйзер и др., 2002; Глухак-Хейнрих и др., 2003), что приводит нас к заключению об осторожном их использовании, особенно с точки зрения недостатка знаний относительно молекулярного состава  зубной матрицы рыб.

Основанной особенностью, наблюдаемой в нашей системе in vitro являлось медленное развитие зубов (отставание на 50 часов у обоих видов). Такое отставание замечено также в экспериментах, проведенных Коуменсом и Сайром (1996) и может приписываться эпителию, который имея покрытие секциями тканей, перед дифференцировкой может вырастать. Мияке и Хелл (1994) продемонстрировали быстрое развитие парасфеноида in vitro по сравнению in vivo, хотя другие черепные кости не проявляли подобного ускоренного роста. Повторный анализ нашего in vitro материала может растолковать данный результат.

Присутствие большого количества матричных сосудов в отсутствии минерализации в условиях in vitro проводит альтернативные пути для ингибирования минерализации in vivo, когда изучаются данные структуры (Такано и др.. 2000). Недостаток отложения минералов в культивируемых зубах как Хемихромиса, так и Данио упрощает эксплантирования за счет отсутствия отложений органического фосфата, такого как β-глицерофосфат, в среде (Нивайде и Вюргер 1990) . В зубах грызунов минерализация матрикса несомненно требует сыворотки и/или стимулирующие развитие экзогенные факторы, такие как зародышевый экстракт (Ямада и др. 1980). В условиях культивирования использованных Сакакурой (1986), наблюдалась минерализация как дентина, так и эмали коренных зубов мышей. Другие способные кальцифицироваться матрицы, культивируемые in vitro, также минерализовались в содержащей сыворотку среде (Зеслефф 1976; Сакакура 1986). Скелетные элементы рыб, культивируемые в содержащей сыворотку среде, развивались Мияке и Хеллом (1994), они также имели недостаток минерализации, который приписывался авторами к отсутствию факторов, провоцирующих минерализацию.

В заключении, мы показали, что бессывороточная среда, разработанная Коуменсом и Сайром (1996) позволяет развивать зубные зачатки Хемихромиса и Данио рерио в условиях in vitro от недифференцированного ротового/глоточного эпителия и, когда имеется время эксплантации, продолжать и формирование вплоть до этапа прикрепления. В дополнение, среда позволяет протекать процессам морфогенеза и клеточной дифференцировки зубных зачатков как это происходит in vivo и устанавливать зубной ряд (место и ряд появления зубов и прикрепление). Зубной фенотип, наблюдаемый in vitro, неотличим от наблюдаемого in vivo. Молекулярные данные, тем не менее, нуждаются в подтверждении того, что регуляторные каскады, вовлеченные в эпителио-мезенхимальные взаимодействия, управляют развитием зубов подобно in vivo. Были исследованы лишь немногие гомологи генов млекопитающих и их экспрессия при формировании зубов у дикого типа Данио рерио, что показало как схожие моменты, так и существенные различия (Лауренти и др. 2004; Джексон и др. 2004); это сопоставимо с рядами экспрессии более, чем 200 генов зубов грызунов (преимущественно мышей). Ещё больше данных становится доступными относительно генов, вовлеченных в развитие зубов Данио рерио in vivo, это может быть четко сопоставлено с данными in vitro.

Так как наши условия культивирования позволяют инициироваться in vitro новым зубным зачаткам, и поскольку морфогенез и клеточная дифференцировка продолжаются в очень сходных условиях с ситуацией in vivo, данный метод позволяет проводить исследования, касающиеся эффектов различных экзогенных веществ на стимуляцию и ингибирование различных этапов одонтогенеза при стандартных условиях. Важно, что условия культивирования, описанные здесь позволяют культивировать головы умерщвленных мутантов личиночной фазы развития (Данио рерио) далеко от точки, в которой эмбриона обычно погибали. Аналогично, в исследованиях, с выключением генов антисмысловыми морфологическими олигонуклеотидами происходило ранняя гибель , что может быть выгодно при использовании головных эксплантов при исследовании эффектов на черепно-лицевое развитие. Таким образом, огранотипичная культура в бессывороточных условиях может стать мощным орудием в развитии изучения и раскрытия новых перспектив черепно-лицевых исследований.

———

Данный текст является переводом статьи Tooth development in vitro in two teleost fish, the cichlid Hemichromis bimaculatus and the cyprinid Danio rerio. авторов C. Van der heyden . F. Allizard . J.-Y. Sire . A. Huysseune. Cell Tissue Res (2005) 321: 375–389. Опубликованном в сети: 21 June 2005.
Рассказ идет от первого лица, так как это представлено в оригинале.