Данное исследование проведено для определения токсического воздействия четырех дезинфицирующих веществ, а именно сульфата меди (CuSO₄), перманганата калия (KMnO₄), метиленового синего и малахитового зеленого, на рыб и патогенные бактерии: Аэромонад (Aeromonas sp.), Флюоресцирующую псевдомонаду (Pseudomonas fluorescens) и Эдвардсиеллы (Edwardsiella sp.), флавобактерии (Flavobacterium sp.). Стандартным методом в аквариуме определили смертельную концентрацию дезинфицирующих веществ для мальков вида Labeo rohita. Смертельная концентрация сульфата меди (CuSO₄), перманганата калия (KMnO₄), метиленового синего и малахитового зеленого для рыбы составляла 0.75 мг/л, 7 мг/л, 6 мг/л и 0.5 мг/л при экспозиции 21,4 часа, 18 часов, 9,5 часов и 1,4 часа, соответственно. Метиленовый синий в концентрации 4 мг/л и 5 мг/л препятствовал росту Pseudomonas fluorescens, а концентрация, равная 6 мг/л, подавляла развитие Aeromonas sp.. Сульфат меди (CuSO₄) оказался эффективен только против Edwardsiella sp. в концентрации 10 мг/л и 8 мг/л. Малахитовый зеленый в концентрации 1 мг/л подавлял рост всех четырёх участвующих в эксперименте бактерий. Перманганат калия (KMnO₄) не продемонстрировал никаких сдерживающих эффектов на бактерии даже в концентрации 30 мг/л.

Введение

В Бангладеш большое количество рыбы ежегодно умирает в различных рыбных хозяйствах в связи со вспышками бактериальных и грибковых болезней. Основными бактериальными болезнями в Бангладеш являются аэромоноз, бактериальная геморрагическая септицемия, заражение эдвардсиеллами и столбиковая болезнь (бранхиомикоз и плавниковая гниль), которые вызваны подвижными аэромонадами (Aeromonas sp.), флюоресцентными псевдомонадами (Pseudomonas fluorescens), эдвардсиеллой (Edwardsiella sp.) и бактериями вида Flavobacterium, соответственно. В качестве профилактических и контрольных мер по остановке заболеваний рыбоводы и владельцы рыбозаводов используют различные виды дезинфицирующих средств. Сульфат меди (CuSO₄), перманганат калия (KMnO₄), метиленовый синий и малахитовый зеленый являются известными химическими веществами, используемыми для уничтожения внешних паразитов и грибковых болезней в рыбе. Сульфат меди (CuSO₄) эффективный альгицид, но он оказывает токсическое воздействие на многие виды рыб.

Факторы, влияющие на токсичность меди, связаны с такими характеристиками качества воды, как твердость, щелочность, жесткость и растворенный органический углерод. Увеличение этих параметров качества воды приводит к снижению токсичности меди и последующему увеличению допустимой дозы для рыб, тогда как для контроля над ростом водорослей требуются более высокие концентрации.

Перманганат калия (KMnO₄) токсичен для бактерий и фитопланктона и обычно используется для нейтрализации рыбных токсинов, таких как туботоксин и антимицин. Использование метиленового синего против бактериальных, грибковых и паразитических инфекций выявило, что это средство является эффективным в отношении поверхностных грибковых инфекций рыб. Кроме того, оно убивает растения и бактерии биофильтра в аквариуме. Лекарство может использоваться в качестве альтернативы малахитовому зеленому для контроля роста грибка, если лечение последним веществом невозможно из-за непереносимости у рыбы. Метиленовый синий безопасен для икры рыб и мальков, поэтому его используют для предотвращения грибковых инфекций. Повторно вещество может применяться для уничтожения внешних простейших, таких, как Ихтиофтириоз (Ichthyophthirius), Хилодонелла (Chilodonella) и Костия (Costia). Метиленовый голубой оказался эффективен для снижения бактериальной обсемененности у мальков Нильской тиляпии (Orechromis niloticus). Малахитовый зеленый часто использовался в борьбе с внешней инфекцией, которую вызывают простейшие, и грибковыми болезнями с 1993, но из-за его негативного воздействия на рыбу и водные организмы вещество пока еще не внесли в список ветеринарных препаратов. Однако в Бангладеше рыбаки не знают надлежащих доз дезинфицирующих веществ и часто применяют дезинфицирующие средства в слишком больших дозах, что может привести к интоксикации и даже гибели рыбы. К сожалению, до сих пор не проведено систематического исследования для решения этих проблем.

Учитывая факты, данное исследование проведено для определения токсического воздействия четырех дезинфицирующих веществ, а именно сульфата меди (CuSO₄), перманганата калия (KMnO₄), метиленового синего и малахитового зеленого, на рыб и патогенные бактерии: Aeromonas spp., Pseudomonas fluorescens, Edwardsiella spp. и Flavobacterium spp.

Материалы и методы

Определение смертоносных концентраций для рыбы:

Определение смертельной концентрации дезинфицирующих веществ: сульфата меди (CuSO₄), перманганата калия (KMnO₄), метиленового синего и малахитового зеленого проводилось на рыбе в аквариуме, емкость которого составляла 30 литров воды. Отдельный аквариум наполнили 6 литрами фильтрованной воды. Раствор сульфата меди (CuSO₄) подготовили в концентрациях 0.25 мг/л, 0.5 мг/л, 0.75 мг/л, 1 мг/л, 2 мг/л, 3 мг/л, 4 мг/л, 5 мг/л, 10 мг/л, 20 мг/л и 30 мг/л, в то время как концентрации перманганата калия (KMnO₄) составляли 5 мг/л, 6 мг/л, 7 мг/л, 8 мг/л, 9 мг/л, 10 мг/л. Концетрации метиленового синего составляли 5 мг/л, 6 мг/л, 7 мг/л, 8 мг/л, 9 мг/л, 10 мг/л, 15 мг/л, 20 мг/л, 30 мг/л, 40 мг/л и 50 мг/л. Дозы малахитового зеленого равнялись 0.1 мг/л, 0.25 мг/л, 0.5 мг/л, 0.75 мг/л и 1 мг/л. Концентрации установили с помощью измерения дезинфицирующих средств электрометром и затем растворили в требуемом объеме воды.

В каждый аквариум поместили одно дезинфицирующее вещество в определенной концентрации. Шесть мальков лабео длиной в 8-10 см находились в каждом аквариуме, их состояние отслеживали на регулярной основе.

Определение эффектов, сдерживающих рост числа бактерий

Бактерицидное влияние веществ на четыре рода патогенных бактерий у рыб, а именно аэромонаду, флюоресцентную псевдомонаду, эдвардсиеллу и флавобактерию, определяли в искусственных условиях. В начале эксперимента отобранные штаммы культивировали в питательном бульоне в течение 24 часов в шейкер-инкубаторе с температурой 25°С с поворотом 100 об/мин. Приблизительно 50 микролитров бактериального бульона поместили на пластину с питательным агаром, находящуюся внутри камеры с однонаправленным потоком воздуха, где культуру бактерий распределили по пластине с помощью вращений L-образной стеклянной палочки по часовой и против часовой стрелки. Стеклянную палочку простерилизовали в 70% растворе спирта и пламени горелки. Растворы сульфата меди (CuSO₄), перманганата калия (KMnO₄), метиленового синего и малахитового зеленого в разной концентрации подготовили с использованием обработанной в автоклаве дистиллированной воды. Затем 1 мл каждого раствора разлили в отдельные микроцентрифужные пробирки, а 50 микролитров каждого раствора поместили на пластину с агаром, содержащую посевную культуру. На каждой пластине отмечали концентрацию раствора и номер культуры. Затем эти пластины находились в инкубаторе при 25°С в течение 12 часов. После 12 часов работы инкубатора организм считали чувствительным к веществу, если существовала зона полного ингибирования вокруг инокулированного раствора. Организм считали устойчивым к веществу, если зоны ингибирования не наблюдалось.

Результаты и обсуждение

Аквакультура является важной экономической отраслью Бангладеша. Однако распространение различных болезней, включая бактериальные инфекции, ограничивает производство рыбы в рыбоводческих хозяйствах. Для профилактики болезней рыб и борьбы с ними традиционно используются различные дезинфицирующие средства. Однако эти дезинфицирующие средства токсичны и даже способны привести к гибели рыбы. В настоящем исследовании выявлены смертельные концентрации сульфата меди (CuSO₄), перманганата калия (KMnO₄), метиленового синего и малахитового зеленого для мальков вида роху: 0,75 мг/л, 7,00 мг/л, 6,00 мг/л и 0,50 мг/л за 21,4 часа, 18,0 часов, 9,5 часов и 1,4 часа соответственно. Bills (1974) сообщил о значении ЛК50 малахитового зеленого в размере 2 мг/л для молоди радужной форели.

В искусственных условиях проанализировано подавляющее воздействие четырех дезинфицирующих веществ на четыре основные патогенные бактерии у рыб. Экспериментальные данные свидетельствуют о том, что бактерии флюоресцентная псевдомонада и аэромонада не смогли размножаться при концентрациях метиленового синего, равных 4 мг/л или 5 мг/л и 6 мг/л, соответственно. Рост Эдвардсиеллы прекратился в растворе CuSO₄ с концентрацией 10 мг/л и 8 мг/л. Флавобактерию признали устойчивой к сульфату меди (CuSO₄), перманганату калия (KMnO₄) и метиленовому синему во всех концентрациях, но чувствительной к малахитовому зеленому в концентрации 1 мг/л. Перманганат калия (KMnO₄) не смог остановить развитие ни одного из четырех видов бактерий во всех испытанных концентрациях, в то время как малахитовый зеленый препятствовал росту всех бактерий в концентрации 1 мг/л. Только метиленовый синий оказался способен уничтожить флюоресцентную псевдомонаду и аэромонаду в безопасных для рыб концентрациях.

Таким образом, болезни рыб, связанные с флюоресцентной псевдомонадой и аэромонадой, можно вылечить с помощью метиленового синего без каких-либо негативных последствий для рыбы. Два важных алгицида, сульфат меди (CuSO₄) и перманганата калия (KMnO₄) оказались неэффективны при концентрации ниже летальной. Сульфат меди (CuSO₄) оказался эффективен против эдвардсиеллы в дозах 10 мг/л и 8 мг/л., которые намного превышают смертельные концентрации (0,75 мг/л за 21,4 часа). Таким образом, сульфат меди (CuSO₄) не должен использоваться для профилактики и лечения болезней рыб, вызванных эдвардсиеллой. Перманганат калия (KMnO₄) неэффективен в борьбе с любым из этих четырех типов бактерий даже при концентрации 30мг/л. Таким образом, не следует рассматривать перманганат калия (KMnO₄) для лечения бактериальных болезней рыбы.

Резюме и выводы

Эксперимент проведен для обнаружения смертельных концентраций для рыбы и антибактериального воздействия четырех распространенных дезинфицирующих средств в Бангладеше. В настоящем исследовании установлено, что некоторые дезинфицирующие средства, особенно метиленовый синий и CuSO₄, показали высокую активность в борьбе против аэромонады и флюоресцентной псевдомонады в концентрациях ниже летальной. Выводы, сделанные в ходе настоящего исследования, окажутся полезными для фермеров, занимающихся рыбным промыслом, для профилактики и лечения бактериальных болезней.

Благодарность

Эту исследовательскую работу проводили в лаборатории USDAProject Департамента генной инженерии и биотехнологии, университете науки и техники, Силхет, Бангладеш, который создан при финансовой поддержке Министерства сельского хозяйства Соединенных Штатов в рамках научно-исследовательского проекта под названием «молекулярное обнаружение бактериальных и грибковых болезней карпа и других рыб, а также лекарственных трав для лечения болезней».

——

Alam M, Rahman MM, Foysal MJ and Hossain MN. Determination of lethal concentration and antibacterial activity of commonly used disinfectants. International Journal of Natural Sciences (2011), 1(4):102-105