Введение

Целью стандартной операционной процедуры (СОП) является культивирование Daphnia magna в оптимальных условиях для максимального производства. Методы культивирования адаптированы в соответствии СОП № 120/3, полученного в Центре водных исследований (WRC) в Медменхэме, Великобритания.

Daphnia magna Straus (Cladocera) вывели в Центре водных исследований под началом Национального института прикладных химических исследований (IRCHA) во Франции. Вид классифицирован группой Daphnia в Университете Шеффилда как клон IRCHA типа 5 и культивировался с марта 1999 года в Университете Рединга (группа Каллагана).

В идеальных экологических (лабораторных) физико-химических условиях D. magna размножается партеногенетически, производя клональное потомство. Однако изменение, например, температуры или количества пищи вызвает появление самцов с последующим половым размножением и производством покоящихся яиц (эфипий). Таким образом, появление самцов является индикатором нарушения условий культивирования (например, стресса); самцы не должны присутствовать в лабораторной культуре, выращиваемой в режиме постоянного света, температуры и пищи.

При 20ºC D. magna достигают половой зрелости через 6-8 дней, откладывая яйца в камеру для выводка. Эмбрионы завершают свое развитие внутри выводковой камеры и вылупляются в виде свободно плавающих новорожденных на 8-10 день. В последующие 2-4 дня зрелые самки производят 2-й выводок новорожденных, пик размножения приходится на 3-й выводок (12-14-й день) или 4-й выводок (14-17-й день). По мере взросления дафний время между выводками будет увеличиваться, а размер выводка уменьшаться. Даже при постоянных условиях выращивания размер выводка может варьироваться, например, из-за качества воды и скученности (см. Ниже).

Партеногенетический способ размножения (изолирующая генетическая изменчивость) и короткий жизненный цикл (от яйца до взрослой особи ~ 10 дней) делают D. magna идеальным организмом для изучения реакций на стресс окружающей среды от молекулярного до популяционного уровня.

Культивирование и уход

Приступая к культивированию D. magna, самые первые культуры начинают с 15 (возраст <24 часов) новорожденных на сосуд. Первые новорожденные должны происходить от одной самки, чтобы свести к минимуму клональные различия, такие как возраст достижения зрелости и размер выводка. Будущие культуры стартуют с 15 (возраст <24 часов) новорожденных на сосуд, происходящих из потомства, коллективно произведенного родительскими культурами. Важно начинать новые культуры только с новорожденных, произведенных синхронизированными по возрасту взрослыми. Новые культуры создаются каждые 2-3 недели, и лучше всего начинать с новорожденных 3-5-го выводка. Запуск культур с более ранними выводками может снизить продуктивность, в то время как использование более поздних выводков может привести к генетическому дрейфу.

ОЭСР рекомендует, чтобы культуры/эксперименты не начинались с 1-го выводка.

СОП, созданная Ларсом-Хенриком Хекманном и Ричардом Конноном

D. magna (15 особей) выращивают в пластиковых сосудах объемом 2 л, содержащих 1,2 л воды в соответствии с требованиями стандартов ISO (см. приложение A) с добавлением, в зависимости от возраста дафний (см. пример истории культивирования в приложении C), 3 или 4 мл раствора органической добавки Marinure (приложение B). Добавьте Marinure (хорошо перемешайте) и корм (см. ниже) перед добавлением дафний.

Сосуды следует покрыть пищевой пленкой или диском из плексигласа, чтобы свести к минимуму испарения и уменьшить загрязнение. Все культуры выдерживают в статических условиях при температуре 20±1ºC, с контролем фотопериода 16 часах света и 8 часах темноты.

Культуры следует проверять ежедневно, а больных или мертвых особей удалять. Самцы и/или эфипии также должны быть удалены. Переход к половому размножению может быть вызван изменением температуры, фотопериода и/или уровня/качества пищи. Таким образом, для контроля качества рекомендуется регистрировать минимальную/максимальную температуру ежедневно (или, по крайней мере, еженедельно) и регулярно проверять таймеры фотопериода и культуры водорослей.

Дафний кормят один раз в день (с понедельника по пятницу) дистиллированной суспензией Chlorella vulgaris 0,5-2,0 мл (см. Приложение C и СОП по C. vulgaris). Рацион водорослей увеличивают по мере взросления дафний и оставляют постоянным, как только они достигают зрелости (Приложение С). Вместе с водорослями добавляют 0,5 мл на культуру в день 100 мг/л суспензии сухих пекарских дрожжей (приложение D).

Новорожденных необходимо удалять ежедневно перед кормлением (с понедельника по пятницу), чтобы избежать скученности и обеспечить постоянный уровень питания для взрослых-производителей. Новорожденных удаляют либо пластиковой пипеткой, либо при замене воды. Рекомендуется вести учет рождаемости новорожденных, чтобы следить за здоровьем взрослых-производителей и для сравнения с хронологическими записями. Всех неиспользованных новорожденных выбрасывают в раковину или предпочтительно используют в качестве корма для рыб.

Воду следует менять на еженедельной основе (минимум), чтобы обеспечить оптимальный химический состав воды. Взрослых особей переносят пластиковой пипеткой (кончик отрезают в соответствии с размером их тела) в сосуды, содержащие свежую среду ISO, водоросли, дрожжи и раствор Marinure. Использованные сосуды необходимо промыть моющим средством и оставить на ночь под медленным потоком воды для промывания в раковине.

Материалы и методы

Маркировка

• Название организма
• Дата начала культуры
• Инициалы оператора

Устройство

• Измеритель растворенного кислорода
• Измеритель проводимости
• Измеритель рН
• Цифровые термометры
• Жесткость воды (Приложение А)

Ведение учета, отчетность, хранение и извлечение

• Кормление, смена воды и общие параметры здоровья культуры записываются в паспортах данных и архивируются.
• Копии учебных планов и СОП должны быть распространены среди всех задействованных сотрудников.
• Дафнии, используемые для транскриптомных исследований, хранятся в RNA later® при температуре –80ºC, в то время как незадействованные особи выбрасываются.

Приложение А: Среда для культивирования Daphnia magna (модифицирована в соответствии со стандартным протоколом ISO)

• Взвесить указанные количества следующих солей на 1 л требуемого объема среды:
• 195,87 мг CaCl 2·2H2O (хлорид кальция)
• 82,20 мг MgSO 4·7H2O (сульфат магния)
• 64,80 мг NaHCO3 (гидрокарбонат натрия)
• 5,80 мг KCl (хлорид калия)
• 0,002 мг Na2SO3 (селенит натрия)*

*Приготовить исходный раствор с концентрацией 40 мкг/мл (срок годности 1 год)

• Растворить хлорид кальция отдельно в 300-500 мл воды обратного осмоса (RO) с помощью магнитной мешалки.
• Добавить раствор хлорида кальция в необходимый объем горячей воды, прежде чем продолжить.
• Растворить оставшиеся соли вместе в 300-500 мл горячей воды с помощью магнитной мешалки.
• Добавить растворенные соли в необходимый объем горячей воды и перемешайте.
• Оставить среду минимум на 12 часов, чтобы обеспечить правильное перемешивание соли и сохранить ее аэрированной.
• Измерить рН, электропроводность и жесткость воды перед использованием, чтобы обеспечить соответствующий химический состав воды:
  • рН должен быть от рН 7,5 до рН 8,2
• Электропроводность должна составлять от 360 до 480 мкс*/см (*микросименс)
• Жесткость воды должна от 130 до 160 мг /л (измеряется как CaCO 3) и измеряется титрованием (https://en.wikipedia.org/wiki/Titration):
  • Добавьте 100 мл подготовленной питательной среды в стакан/коническую колбу.
  • Добавьте 5 мл буферного раствора Аммиак-Хлорид аммония (Fisher Scientific, каталог № J/2500/17) в стакан.
• Добавить 10 капель насыщенного раствора индикатора Eriochrome Black T (Fisher Scientific, каталог № 22836-0250) в сосуд.
• Добавить X мл титранта, 0,01 М ЭДТА (Fisher Scientific, каталог № J/3720/17), в сосуд, используя бюретку объемом 25 мл.
• Обратите внимание на точный объем титранта, необходимого для изменения цвета раствора анализируемого вещества, чтобы изменить цвет с фиолетового на синий (1 мл титрующего буфера равен 10 мг CaCO 3/л, например, 15,3 мл соответствует жесткости воды 153 мг/л).
• Записать номер партии носителя (маркируйте партии в хронологическом порядке по мере их подготовки), данные о химическом составе воды, дату приготовления и инициалы оператора.
• Питательную среду можно использовать в течение одного месяца после приготовления, после чего она должна быть утилизирована.

Приложение В: Приготовление пищевой добавки для культур Daphnia magna

Marinure, стандартный органический экстракт, можно приобрести в Glenside Organics.

• Чтобы получить 1 л Marinure, растворить приблизительно 9-10 мл концентрированного экстракта (удалите с помощью пипетки Gilson5000) в 1 л дистиллированной воды (с усилием встряхивайте раствор до полного растворения экстракта).
• Развести Marinure в соотношении 1:10 (например, 1,8 мл дистиллированной воды до 0,2 мл растворенного Marinure) в одноразовом пластиковом сосуде.
• Измерить оптическую плотность разбавленного образца 1:10 (OD1:10) с помощью спектрофотометра (не забудьте использовать пустой контрольный сосуд, содержащий 2 мл дистиллированной воды).
• При длине волны 400 нм OD образца, разбавленного 1:10, должен составлять 0,800 (±5%, т.е. OD1:10 должно быть в пределах 0,760 и 0,840).
• Если значение выше или ниже OD1:10 = 0,800 (> 5%), добавить немного больше экстракта или немного больше дистиллированной воды в смесь соответственно.
• Заново разбавить модифицированный экстракт 1:10 (после добавления большего количества экстракта или воды) в новый пластиковый сосуд (использовать тот же контрольный бланк).
• Измерить OD1:10 модифицированного запаса. Продолжать, как указано выше, до спектрофотометрического показателя измерения равного 0,800 (±5%).

• Маркировать запас экстракта, например

Marinure OD1:10 (400 нм) = 0,800

Дата изготовления

Срок годности (срок годности 6 месяцев)

Инициалы

• Добавить 3 мл Marinure к 1,2 л культуральной среде при запуске/обновлении среды для выращивания дафний, содержащей дафний возрастом менее 7 дней.

Приложение C: Пример хронологии культуры

Daphnia magna — Лист данных

Дата начала выращивания культуры — 01/03/2006
Инициалы оператора — LHH
Указание культуры — 21A-C

Дата	День	Культура f# основание		ind.l	Молодняк			Корм		Обновление воды		Примечания
		A	В	С	A	В	С	Водоросли (мл)	Дрожжи (мл)	Партия	Marinure (мл)
01/03	1	15	15	15				1,0	0,5	32	3,0
02/03	2							1,0	0,5
03/03	3							1,5	0,5			на 50% больше корма по пятницам
04/03	4											Выходные без кормления
05/03	5											Выходные без кормления
06/03	6							1,5	0,5
07/03	7							1,5	0,5
08/03	8	15	15	15				2,0	0,5	32	4,0	Замена воды
09/03	9				<100	<100	<100	2,0	0,5			1-ый выводок
10/03	10				<100	<100	<100	3,0	0,5			на 50% больше корма по пятницам
11/03	11											Выходные без кормления
12/03	12											Выходные без кормления
13/03	13				-200	-250	-200	2,0	0,5			Удален второй выводок
14/03	14	15	15	14	<100	<100	<100	2,0	0,5	32	4,0	Замена воды, удалиление новорожденных
15/03	15							2,0	0,5			Отсутствие мальков в 14:30
16/03	16				-250	-300	-200	2,0	0,5			Новые культуры приостановлены (3-й выводок)
17/03	17							3,0	0,5			на 50% больше корма по пятницам
1803	18											Выходные без кормления
19/03	19											Выходные без кормления
20/03	20				>300	>300	>300	2,0	0,5			3-й/4-й выводок удален
21/03	21	15	15	14	<100	<100	<100	2,0	0,5	33	4,0	Замена воды
22/03	22							2,0	0,5
23/03	23							2,0	0,5
24/03	24											Утилизация (воспроизводство новых культур)

Дрожжи добавляют с постоянной скоростью 0,5 мл (100 мг/л) на протяжении всего процесса, в то время как количество водорослей увеличивается до тех пор, пока дафнии достигают зрелости: 1,0 мл водорослей на 1-2-й день; 1,5 мл водорослей на 3-7-й день; 2,0 мл водорослей на 8^й+ день (NB! 1 мл водорослей эквивалентен 0,50 мг углерода при OD1:10 (440 нм) = 0,800 – для получения дополнительной информации см. СОП на Chlorella vulgaris). Обратите внимание, что по пятницам рационы с водорослями увеличиваются на 50%, чтобы компенсировать отсутствие кормления в выходные.

Приложение D: Приготовление раствора хлебопекарных дрожжей для культур Daphnia magna

100 мг/л пекарских дрожжей:

• Взвесить ~ 10 мг сухих пекарских дрожжей и перелейте их в бутылку с синей крышкой.
• Добавить 100 мл дистиллированной воды.
• Использовать магнитную мешалку, чтобы «ускорить» растворение дрожжей.
• Ежедневно (с понедельника по пятницу) к культурам добавлять 0,5 мл раствора дрожжевого бульона (100 мг/л).
• Обновлять запасы каждые 1-2 недели.

——
Lars-Henrik Heckmann and Richard Connon. Culturing of Daphnia magna — Standard Operating Procedure. Daphnia Research group (University of Reading)