В рыбоводстве наркотизация рыб необходима для снижения стресса, предотвращения повреждений во время манипуляций с рыбой (например, искусственного оплодотворения, маркирования, биометрической оценки, биопсии, гормональной обработки, проверки здоровья). Согласно распространенному мнению, идеальный анестетик должен удовлетворять следующим требованиям: вызывать быструю анестезию с постепенным её исчезновением; быть нетоксичным для рыб; легко готовиться персоналом; быстро метаболизироваться и выводиться организмом; не оставлять остатков; быть дешевым (Marking and Meyer, 1985; Keene et al., 1998; Tye and Page, 1998; Morgan and Groot, 2002).

В последнее время гвоздичное масло (Cariophylli acetheroleum, Oleum Caryophylli), масло цветков гвоздики Caryophylli floris aetheroleum) начали использоваться в качестве анестетиков для рыб. Они производятся из сухих цветущих почек деревьев Jambosa caryophyllus и Eugenia caryophallata. Гвоздичное масло — жидкость с приятным запахом, имеет слегка желтоватый или коричневатый оттенок и жжет язык при приеме внутрь (Czech Pharmacopoedia, 1997). Гвоздичное масло обладает антисептической, антибактериальной, антивирусной, анальгезирующей, антиоксидантной и антигистаминной активностью.

Согласно Hermanini и Tangendjaja (1988), эвгенол (4-аллил-2-метоксифенол) является активным компонентом гвоздичного масла и составляет 70-90% от массы масла. К другим компонентами масла относятся эвгенола ацетат (>17%) и картифилин-5 (12%). Различные терпены в составе продукта придают ему характерный вкус и запах (Ross and Ross, 1999).

С точки зрения безопасности употребления в пищу человеком детально изучался эвгенол. Было показано, что гвоздика, гвоздичное масло и эвгенол полностью безопасны для организма человека в концентрациях до 1500 ppm (USFDA, 1978). Эвгенол и его производные метаболиты быстро покидают кровяное русло и ткани человека, принявшего это вещество. Они не токсичны и не обладают канцерогенными свойствами (Fischer and Dengler, 1990).

В Индонезии гвоздика веками использовалась в качестве местного обезболивающего при головных, зубных болях и артрите (Ross and Ross, 1999; Talor and Roberts, 1999). В этом плане эвгенол оказывает широкий спектр эффектов, включая антиоксидантный (Kramer, 1985; Nagababu and Lakshmaiah, 1992; Pulla Reddy and Lokes, 1992; Rajakumar and Rao, 1993), противогрибковый (Bullerman et al., 1977; Karapmar, 1990), антибактериальный (Karapmar and Aktug, 1987; Briozzo et al., 1989; Moleyar and Narasimham, 1992) эффекты. Интересно, что эвгенол входит в состав некоторых сортов сигарет (La Voie et al., 1986; Council of Scientific Affairs, 1988; Guidotti, 1989). Endo с коллегами (1972) описали обезболивающий эффект гвоздики на животных.

Гвоздичное масло, вследствие своей дешевизны и безопасности для человека и среды, является перспективным анестетиком для рыб (Waterstrat, 1999, Griffiths, 2000. Cho and Heath, 2000. Mylonas et al., 2005, Soto and Burhanuddin, 1995).

Его наркотизирующие свойства и время восстановления зависят от применяемой дозы и длительности обработки (McFarland, 1959; Jolla et al., 1972; Hikasa et al., 1986; Roubach et al., 2005; Mylonas et al., 2005).

В рамках данной статьи отмечены результаты использования гвоздичного масла в концентрации 0.02 — 0.07 мл/л (компания Dr. Kulich, Чехия). Свойства анестетика оценивались в зависимости от температуры и вида рыб (линь, карп, окунь, Африканский сом, Нильская тиляпия, стерлядь, Сибирский осетр). Для некоторых рыб температура подбиралась на основе её соответствия физиологическим потребностям конкретного вида. В проведенных экспериментах температура воды находилась в диапазоне 4-25 градусов Цельсия. Время выдерживания в растворе гвоздичного масла составляло 10 минут. Спустя 10 минут обработки, особи перемещались в аквариум с чистой водой, и регистрировались отдельные фазы действия анестетика (0, I, IIa, IIb, III) (Trzebiatowski et al., 1996). Дополнительно, наркотизирующий эффект оценивался по шкале Kazun et al., 1999.

Для форели, налима и карпа рассчитывалась летальная концентрация. Острое токсическое действие гвоздичного масла для карпа (возраст меньше года, 11 граммов) определено в четырех температурных режимах (10, 15, 20, 25°C) и различных режимах обработки (5, 10, 20 40 минут). Острая токсичность оценивалась по параметру полулетальной концентрации (LC50) с включением доверительного интервала (вероятность 95%).

	Фаза	Описание
Наркотизация	0	Физиологическое положение тела. Нормальная локомоторная активность.
	I	Физиологическое положение тела. Повышенная локомоторная активность.
	II a	Сниженная локомоторная активность. Особь слегка лежит на боку.
	II b	Положение на боку. Обездвиживание.
	III	Остановка дыхания.
	II b	Положение на боку. Обездвиживание.
Выход из анестезии	II a	Нескоординированные движения. Признаки физиологического положения тела.
	I	Физиологическое положение тела. Сниженная локомоторная активность.
	0	Физиологическое положение тела. Нормальная локомоторная активность.

Таблица 1. Классификация фаз наркоза.

Результаты
Для наркотизации большинства видов рыб (стеклянного карпа, пескаря, хариуса, линя, налима, окуня, барбусов, красноперки, форели, щуки и тиляпии) достаточно 0.033 мл/л раствора гвоздичного масла.

На сеголетках африканского сома (5-15 г; длина 85-125 мм) опробовано несколько концентраций раствора (0.0089; 0.0133; 0.0200; 0.0300; 0.0450; 0.0675 мл/л) в различных температурных режимах (20.0; 22.5; 25.0°C). Даже в концентрации 0.02 мл/л 3-я фаза не отмечалась. Лишь в растворе 0.03 мл/л при температуре 25°C у 60% особей наступала третья фаза наркотизации. При концентрации 0.0675 мл/л третья фаза наступала у всех особей при любой температуре (Karvankova, 2003).

Эффекты раствора 0.033 мл/л гвоздичного масла проверялись на окуне (Perca fluviatilis, масса 32.2 — 40.4 граммов). Экспозиция проводилась в течение 10 минут при температуре 12.5; 15.0; 17.5 и 20.0°C. Терминальная третья стадия наркоза достигалась у всех особей после 6,98 минут (17.5°C); 7,57 минут (12.5°C); 3,73 минут (20.0°C). Время восстановления варьировало от 6,06 минут (12.5°C) до 9,21 минуты (15.0°C), либо от 3,69 минут (20.0°C) до 7,44 минут (12.5°C). особенности температурного режима не влияли на эффективность наркоза (Hamackova et al., 2001b).

Характер возникающей анестезии после обработки 0.07 мл/л раствором гвоздичного масла при температуре 4; 8; 12; 16 и 20°C определялся на Сибирском осетре (Acipenser baeri, 100 — 180 г) и стерляди (Acipenser ruthenus, 115 — 140 г) в возрасте менее года. На начальном этапе поверхностная анестезия (IIb) зарегистрирована через 53.1 — 83,4 секунды при температуре 20°C и 122,2 — через 180.6 секунд при 4°C. На основе полученных результатов анестетик можно рекомендовать для представленных видов рыб.

У карпа была отмечена отрицательная зависимость полулетальной дозы (LC50) от температуры воды и времени обработки. Наименьшее значение полулетальной дозы (LC50 — 0.027 мл/л) наблюдалось при высокой температуре (25°C) и длительной обработке (40 минут). С другой стороны, максимальная полулетальная доза (0.752 мл/л) достигалась при низкой температуре (10°C) и короткой экспозиции (5 минут) (Chmel, 2002).

Начальная фаза анестезии и длительность отдельных фаз также изучена на американском гольце (Salvelinus
fontinalis). Особей массой 30 — 40 граммов выдерживали в растворе гвоздичного масла (от 0.033 до 1,5 мл/л). Третья фаза наркоза не достигалась при концентрации 0.033 — 0.04 мл/л. В растворах 0.033 — 0.2 мл/л случаев гибели рыбок не зафиксировано. Значение полулетальной дозы LC50 составило 0.61 мл/л, а летальной дозы LC100 — 1.92 мл/л.

Обсуждение
В своей работе, Anderson с коллегами (1997) сравнил эффективность MS-222 и гвоздичного масла на молоди и взрослых особях радужной форели (Oncorhynchus mykiss). Исследователь получил аналогичные результаты и предложил использовать гвоздичное масло вместо MS-222. На основе данных, полученных на лине,окуне, налиме, сомах, щуке, радужной форели, американском гольце, карпах и красноперке, гвоздичное масло можно рекомендовать как альтернативу для 2-феноксиэтанола (Stupka, 2002; Hamackova et al., 2000, 2001b, 2004b; Karvankova, 2003).

Сравнение эффективности гвоздичного масла с 2-феноксиэтанолом в отношении наркотизации Европейского морского судака и Золотистого спара показало, что гвоздичное масло может использоваться в 10-кратно более низкой концентрации (Mylonas et al. 2005).

Erdmann (1999) изучал физиологические стрессорные реакции у молоди лосося (Oncorhynchus tschawytscha) на наркоз после обработки рыб гвоздичным маслом и трикаином (MS-222), и рекомендовал гвоздичное масло как безопасный, дешевый и безвредный для окружающей среды анестетик.

Tamaru с коллегами (1996) использовали гвоздичное масло и 2-феноксиэтанол при проведении биопсии и взвешивании Серебристого сигана (Siganus argentus), и отметили более высокую эффективность масла как анестетика. Adamek (1999) успешно наркотизировал особей Японской оризии (Oryzias latipes) гвоздичным маслом во время сбора икринок и также указал на высокую безопасность и безвредность данного вещества. Munady и Wilson в 1997 году провели исследование нескольких анестетиков, хиналдина, бензокаина, трикаина (MS-222), 2-феноксиэтанола и гвоздичного масла на коралловых рыбках вида Pomacentrus amboinensis. Гвоздичное масло оказалось чуть менее эффективным по сравнению с хиналдином, но более эффективным по сравнению с другими анестетиками. Более того, в отличие от хиналдина, наркотизация рыбок маслом проходила более плавно, а сам наркоз держался в 2-3 раза дольше, чем для других анестетиков. Выживаемость рыбок была наиболее высокой при использовании масла. Авторы работы рекомендовали гвоздичное масло как эффективное средство наркотизации.

Для приготовления эмульсии гвоздичного масла Durwille и Collet (2001) советовали придерживаться следующего протокола: известный объем масла смешивают с водой и встряхивают бутылку. Те же авторы не обнаружили связи между массой тела рыбок и необходимой дозой гвоздичного масла (тестировались концентрации 0,025 — 0,2 мл/л). Они советовали использовать данный анестетик для рыб массой менее 1 грамма. Во время экспериментов с сеголетками и посадочным материалом карпа зарегистрирована зависимость токсичности масла от массы тела рыбы. Особи большей массы имели в 2-3 раза более высокую восприимчивость к анестетику (LC50).

В экспериментах на лососе Oncorhynchus tshawytscha и O. mykiss было показано, что полулетальная доза при 10 минутной экспозиции составляет 62 мг/л (0,059 мл/л в пересчете) и 96 мг/л (0,092 мл/л), соответственно (Taylor and Roberts, 1999). В аналогичных условиях значения полулетальной дозы для радужной форели и Acipenser transmontanus достигали 250 мг/л (0,238 мл/л) и 526 мг/л (0,502 мл/л), соответственно. Для всех видов концентрация 0,024 мл/л гвоздичного масла оказалась безопасной и достаточной для наркотизации.

Keene с коллегами (1998), работая с молодью радужной форели, раскрыл полулетальную дозу 9 ppm (0,009 мл/л) при экспозиции 8 — 96 часов. Авторы работы отметили более быструю наркотизацию при использовании гвоздичного масла по сравнению с MS-222, однако пробуждение было в 6-10 более длительным. Согласно им, доза 40-60 ppm (0,04-0,06 мл/л) достаточна для достижения скорой наркотизации и относительно короткого времени восстановления молоди радужной форели.

Проверка острой токсичности 30 мг/л раствора гвоздичного масла для карпа и радужной форели путем гематологического и гистологического анализа не выявила необратимых нарушений у рыб (Velisek et al., 2005a, b).

С целью исследования безопасной наркотизации рыб вида Colossoma macropomum Roubach с коллегами (2005) выдерживал особей в течение 10 минут в растворе 35 — 135 мг/л гвоздичного масла. Помимо этого, авторы работы рассмотрели эффекты анестетика в 30-минутный период и определили, что в данном временном промежутке концентрация масла 65 мг/л не приводит гибели рыб и является безопасной.

Таблица 2. Сводная таблица на основе литературных данных. Концентрация гвоздичного масла (мл/л) и температура воды при проведении наркотизации рыб.

Таким образом, для наркотизации большинства исследованных видов рыб достаточной оказывается концентрация гвоздичного масла 0,033 мл/л; а для осетровых — 0,07 мл/л. Скорость достижения II b и III фаз наркоза прямо пропорциональна температуре воды.

На основе литературных данных, можно рекомендовать гвоздичное масло в качестве анестетика для рыб. Этот натуральный продукт является экономически выгодным, безопасным для рыб и окружающей среды.
——
J. Hamackova, J. Kouril, P. Kozak, Z. Stupka. Clove Oil as an Anaesthetic for Different Freshwater Fish Species. Bulgarian Journal of Agricultural Science, 12 (2006), 185-194.