Для улучшения непрерывного производства пищевого белка и сохранения высокого качества воды необходимо разработать практические методы снижения нитрат-азота в системах культивирования. Традиционные системы очистки сточных вод вовлекают в процессы денитрификации перерабатывающих метанол гетеротрофов. Тем не менее, переход к автотрофной денитрификации с использованием серы исключает необходимость в дорогих источниках углерода. В данной работе оценен потенциал утилизации нитратов биофильтрами с псевдоожиженным слоем серы применительно к обработке загрязненной воды аквакультуры.

Три биофильтра (высота 3.9 м, диаметр 0.31 метра, операционный объем 0.206 м³) наполняли частицами серы (0.3 мм эффективный размер частиц, высота статичного слоя примерно 0.9 метра). Каждый биофильтр работал с повторениями. Фаза 1: 37-39% расширение псевдоожиженного слоя, время гидравлического удержания 3.2-3.3 минуты, гидравлическая нагрузка 860-888 л/м²*мин. Фаза 2: 42-13% расширение псевдоожиженного слоя, время гидравлического удержания 3.2-4.8 минуты. В ходе фазы 1, несмотря на прохождение через каждый биофильтр всего 1.57±0.15 и 1.82±0.32 мг NO₃-N/л, степень удаления NO₃-N была наибольшей для реакторов со слоем серы (0.71±0.07 и 0.80±0.15 г N удаление/литр биоректора в день). Более низкое от ожидаемого образование сульфата и потребление щелочей указывает на то, что некоторая доля редукции NO₃-N приходилась на гетеротрофную денитрификацию, т.е. в целом, отмечалась миксотрофная денитрификация. Микробный анализ показал присутствие Thiobacillus denitrificans, хорошо известного автотрофного денитрификатора, а также нескольких гетеротрофных денитрификатора. Фаза 2 показала, что пролонгированное время удержания приводит к лучшему удалению NO₃-N и образованию сульфата. Но повышая время удержания путем манипуляций с водным потоком, возникают сложности формирования псевдоожиженного слоя из частиц серы.

Введение

Удовлетворение мирового спроса на пищевой белок должно проводиться с оглядкой на экологическую безопасность систем производства. Наземные системы удержания, использующие технологию замкнутого водоснабжения, определенно созданы для выращивания ценных видов животных с незначительным влиянием на окружающую среду. Однако, хотя большинство таких систем спроектировано для удаления взвешенных частиц и вторичного использования воды, неспособность утилизировать нитрат-азот из воды существенно снижает их экономическую и экологическую устойчивость (Summerfelt and Vinci, 2008; Timmons and Ebeling,2010). Для этих систем актуальна проблема экологической безопасности, поэтому прилагаются усилия для снижения неорганических соединений азота в сточных водах. Важно, способность уверенно и последовательно удалять нитрат-азот из стоков УЗВ позволит расширить эту отрасль сельского хозяйства в регионах, где выдвигаются строгие требования к качеству воды, и потенциально позволит вторично использовать обработанные сточные воды. Стоит важная задача разработать практичные и недорогие методы снижения нагрузки нитрат-азота, и, соответственно, сформировать условия высокой продуктивности непрерывного культивирования, с сохранением высокого качества воды и экологической безопасности.

Распространенные системы денитрификации сточных вод основаны на гетеротрофной денитрификации с добавлением метанола (Payne, 1973). Однако, автотрофная денитрификация с использованием серы, где донорами электронов выступают восстановленные формы серы (тиосульфат, элементная сера), а не органический углерод, имеет несколько уникальных преимуществ (Уравнение 1). По сравнению с гетеротрофной денитрификацией, автотрофные процессы не требуют дополнительных потенциально дорогих источников углерода, производят меньше бактериального осадка и облегчают обработку (Batchelor and Lawrence, 1978; Koenig and Liu, 1996; Zhang and Lampe, 1999). Элементная сера многообещающий субстрат для автотрофной денитрификации, потому что она недорогая и нетоксичная (Batchelor and Lawrence, 1978; Sahinkaya and Kilic, 2014; Sahinkaya et al., 2014).

NO₃⁻ + 1.10S + 0.40CO₂ + 0.76H₂O + 0.08NH₄⁺ → 0.08C₅H₇O₂N + 0.50N₂ + 1.10SO2− 4 + 1.28H⁺ (Уравнение 1)

Основным недостатком этого процесса является более медленный рост автотрофов, по сравнению с гетеротрофами и, следовательно, более низкая скорость денитрификации (Sahinkaya and Kilic, 2014). Побочными продуктами автотрофной денитрификации с использованием серы являются сульфат и рост кислотности (Sahinkaya and Kilic, 2014). На каждый удаленный 1 мг NO₃-N расходуется 4.57 мг CaCO₃ и образуется 7.54 мг сульфата (Sahinkaya et al., 2014). Во многих исследованиях денитрификации с серой в качестве буфера при снижении щелочности и pH среды используют смесь серы и извести или доломита (Sahinkaya and Kilic, 2014; USEPA, 1978).

Присутствие серы в системе и низкая концентрация кислорода приводят к образованию сульфида, что не соответствует результатам уравнения 1. Дополнительной проблемой является низкая растворимость серы в воде и её низкая доступность для бактерий при комнатной температуре. Batchelor и Lawrence (1978) подчеркивали, что для протекания денитрификации с серой необходимо три условия: 1. Нужно растворить серу, 2. Нитрат следует переводить из раствора на поверхность биопленки, 3. Если удастся, направить нитрат через пленку, где пойдет денитрификация.

Денитрификация с серой в статичном слое доказала свою эффективность в обработке нитрата грунтовых вод, при выщелачивании мусора и обработке сточных вод (Koenig and Liu, 1996; Lee et al., 2008; Shao et al., 2010). Этот метод открывает уникальные возможности очистки стоков из аквакультуры (Sher et al., 2008). Степень удаления азота в предшествующих лабораторных исследованиях обычно составляла 0.1-0.4 г N/л-день (Lampe and Zhang, 1996; Sahinkaya and Kilic, 2014; Sahinkaya et al., 2014). Активность утилизации NO₃-N может ограничиваться концентрацией нитратов. Kim et al. (2004) наблюдали снижение степени удаления N при концентрации NO₃-N более 2.5 кг/м³-день. Koenig и Liu (1996) отметили, что лимитирующим фактором в фильтре с упакованным слоем серы является поверхностная нагрузка азотом (г N/м²-день). В условиях аквакультуры Sher et al. (2008) докладывал о том, что использование автотрофной денитрификации имеет двойное преимущество для рециркулирующей воды; под контролем находится не только уровень нитратов, окисление сульфида в анаэробных условиях осадка устраняет проявление токсичности сульфида в системе.

Реакторы с псевдоожиженным слоем доказали эффективность в обработке воды в аквакультуре. Они не забиваются, легки в обслуживании, недорогие и эффективные (Summerfelt, 2006). Так как песочные биофильтры с псевдоожиженным слоем распространены в этой индустрии, их применение в качестве реакторов автотрофной денитрификации с псевдоожиженным слоем серы может стать закономерным развитием технологии. Биофильтры со слоем серы изучали в лабораторных масштабах, Kim et al. (2004) показал, более высокую степень удаления N псевдоожиженным слоем серы, чем статичным слоем серы. Это обусловлено отсутствием загрязнения и хорошим переносом нитрата к поверхности серы в псевдоожиженной системе. В ранней работе Christianson и Summerfelt (2014) определили скорости псевдоожижения коммерческих хлопьев серы, зерен серы и порошковой серы, и заключили, что зерна обеспечивают наиболее реалистичные условия для полномасштабного тестирования биофильтра денитрификации с псевдоожиженным слоем серы. В данной статье оценен потенциал удаления нитрата биофильтрами с псевдоожиженным слоем серы в условиях аквакультуры.

2. Материалы и методы

2.1. Экспериментальная установка биофильтра с псевдоожиженным слоем серы

В институте Пресных Вод (Шепердтаун, Западная Виргиния, США) работало три биофильтра (285 литров, высота – 3.9 м, диаметр – 0.31 м, Рисунок 1) в течении 253 дней.

Измеряли удаление нитрата из загрязненной воды аквакультуры. Имели две фазы экспериментов: Фаза 1 – 225 дней, 13 марта 2014 по 23 октября 2014 год. Фаза 2 – 28 дней, 24 октября 2014 по 20 ноября 2014 год. В течение фазы 1, три биофильтра работали с трехкратным повторением, каждый имел 37-39% подъем слоя, время гидравлического удержания – 3.2-3.3 минуты и гидравлическую нагрузку – 860-888 л/м²*мин, среднюю скорость водного потока – 63-65 л/мин. На двух периодах исследования фазы 1 устанавливали относительно стабильные концентрации нитрата для анализа; периоды 1 и 2 позволяли оценить влияние концентраций 2.0-5.0 и 7.6-17 мг NO₃-N/л, соответственно (дни 57-92 и 190-225, соответственно; по шесть точек измерения для каждого). На фазе 2 прибегали к различной скорости водного потока в каждом биофильтре для оценки влияния времени гидравлического удержания на удаление нитрата (т.е. без повторений; подъем слоя – 42-13%; время гидравлического удержания — 3.2-4.8 мин; скорость водного потока — 67-43 л/мин; поступление – 8.5-15 мг NO₃-N/л).

Ранее Tsukuda et al. (2015) описали схему биофильтра, загрязнения и систему очистки грязной воды (Рисунок 2). Кратко, осадок загрязнений от выращивания Радужной форели (Oncorhynchus mykiss) и Атлантического лосося (Salmo salar) концентрируется через микросетчатый барабанный фильтр и радиальный сепаратор, и нагнетается в серию гравитационных конусов отстойников загустителей. Из конусов, через перелив, надосадочная жидкость поступает в резервуар, питающий биофильтры денитрификаторы. Перелив из каждого биофильтра обрабатывают при помощи радиального сеператора. Высотой слоя в биофильтре (2.82 метра, объем биофильтра – 0.206 м³) управляли смесительным насосом, расположенным сверху каждого биофильтра. Глубина статичного слоя серы примерно составляла 0.9 метра, хотя зерна серы во всех биофильтрах восполняли на 181 и 198 дни. Происходила нерегистрируемая утечка серы, поэтому всего внесли 68 кг серы на 0.75 метра для каждого биофильтра. Уровнем, поступающего в биофильтр, нитрата манипулировали дозированным внесением раствора нитрата натрия (NaNO3; 34.0 г NO₃-N/л) в надосадочную жидкость, питающего биофильтр резервуара. УЗВ питали родниковой водой с естественной щелочностью (примерно 275 мг CaCO₃/л), поэтому вода в системе имела высокую щелочность.

Зерна серы имели эффективный и рассчитанный размер 0.30 (D10) и 1.31 мм (D90), соответственно, и коэффициент однородности 3.1 (Georgia Gulf Sulfur, Customer Code 1660, distributedby Prince Agri-Products, Inc., Quincy, Illinois, USA; Christiansonand Summerfelt, 2014). Эти параметры меньше, чем диапазон 2-16 мм размера зерен серы, о котором докладывали в других экспериментах с денитрификаторами (Koenig and Liu, 1996; Ohet al., 2003; Sahinkaya et al., 2014). Sahinkaya и Kilic (2014) докладывали об использовании наиболее похожего размера зерен (0.5-1.0 мм) в работе с упакованными колонами, и лишь в одном исследовании с псевдоожиженным слоем. Kim et al. (2004) использовали зерна серы 2.0-3.35 мм. Наименьший размер зерен в этой работе обеспечивает желательную высокую специфическую площадь поверхности (SSA: 4110 м²/м³) по сравнению, например, со средним размером 4.4 мм, который имеет SSA 1363 м²/м³ (Koenig and Liu,1996). Изначально, в биофильтрах исследовании с псевдоожиженным слоем использовали порошковую серу, однако прекратили по причине сложности подъема слоя и вымывания. Lampe и Zhang (1996) также сообщали о сложностях использования порошковой серы в реакторе периодического действия (т.е. равномерное перемешивание проблематично).

2.2. Параметры качества воды и анализ

Образцы воды забирали из заслонок, расположенных сзади каждого из трех биофильтров и непосредственно из супернатант-резервуара ( отстойник с надосадочным слоем воды). Т.е. значения образца выходящего потока из биофильтров объединяли как повторения в фазу 1, n=3; образцы поступающего потока, n=1. Химический анализ проводили еженедельно, на протяжении обеих фаз эксперимента протокол измерений был одинаков.

По методу APHA (2005) и Hach Company (2003) измеряли химическое потребление кислорода (COD), углеродсодержащее биохимическое потребление кислорода (cBOD₅), общий аммонийный азот (TAN), нитрит-азот (NO₂-N), нитрат-азот (NO₃-N), общий азот (TN), щелочность, pH, сульфат (S0₄^2-), сульфид (S^2-), общие взвешенные частицы (TSS), общий фосфор (TP), растворенный реакционный фосфор (DRP). По крайней мере, дважды в неделю регистрировали температуру, концентрацию растворенного кислорода (DO), окислительно-восстановительный потенциал (ORP). Измерения проводили непосредственно из супернатант-резервуара (поступающий поток) и открытой верхней части биофильтров (выходящий поток). Регистрировали показатели, как встроенными датчиками, так и портативными приборами (HACH HQ40d Portable meter witheither HACH IntelliCAL LDO101 or MTC101 ORP/redox probe; HACH pHD sc Differential ORP sensor with HACH sc100 controller;HACH Advanced LDO Process Dissolved Oxygen Probe with HACHsc200 controller). Измеряли водный поток через входы к биофильтрам и регулировали его, по крайней мере, дважды в неделю, одновременно, с измерением температуры, DO, ORP, а также перед еженедельным химическим анализом (Dynasonics DXN PortableUltrasonic Measurement System).

Степень удаления NO₃-N, сульфида, щелочей рассчитывали по формуле:

= [(концентрация на входе – концентрация на выходе)*скорость водного потока]/общий объем расширения слоя биофильтра объемом 206 литров (Уравнение 2)

Образование сульфида рассчитывали аналогично, только концентрацию на выходе вычитают из концентрации на входе. Статистический анализ включал t-тест для определения статистически значимых различий между концентрациями параметров на входе и на выходе на протяжении обоих периодов исследования. В случае ненормального распределения данных, как оказалось для большинства концентраций, применяли тест ранговых сумм Манна-Уитни (α=0.05; SigmaPlot 12.5). Эффективность удаления нитрат-N рассчитывали по формуле:

= [(концентрация на выходе – концентрация на входе)*100%]/концентрация на входе (Уравнение 3)

2.3. Сбор и выделение ДНК

На финальный день Фазы 1 периода 2 (день 225) из 3 биофильтров собирали образцы для определения сообщества бактерий, участвующих в денитрификации. Биопленку, прикрепленную к частицам серы, выделяли тщательным вортексированием образца серы/воды из биофильтра в 50 мл стерильных пластиковых конических пробирках в течение 5 минут. Полученную суспензию отслоенного внешнего слоя (SL) пленки центрифугировали при 10000хg, 4°C в течение 20 минут перед выделением ДНК. После отделения SL биопленки полученную среду использовали непосредственно для выделения ДНК внутреннего слоя (IL) биопленки. Геномные ДНК экстрагировали из каждого образца с внутренней и внешней биопленкой с помощью теста Pow-erSoil DNA Extraction Kit (MO BIO Laboratories, Inc., Carlsbad, CA), согласно протокола. Концентрацию и качество выделенной ДНК определяли по поглощению волны 260 нм и соотношению поглощения 260/280 нм, соответственно.

Выделенную ДНК хранили при -20°C.

2.3.1. ПЦР амплификация

Экстрагированная ДНК микробных сообществ из трех биофильтров объединяли в эквивалентных количествах и использовали для амплификации фрагмента nosZ, который кодирует каталитическую субъединицу Z азотистой оксидредуктазы. Применяли праймеры nosZ-F (5′-CGYTGTTCMTCGACAGCCAG-3’) и nosZ-R (5’-CATGTGCAGNGCRTGGCAGAA-3’), дающие фрагменты примерно 700 пар оснований (Rösch et al., 2002). Реакционная смесь ПЦР включала: 2× Taq PCR Master Mix (QIAGEN, Gaithersburg,MD), 6 пмоль прямого и обратного праймера, 100 нг геномной ДНК в окончательном объеме 20 мкл. ПЦР амплификация проводилась следующим образом: изначальная денатурация 94°C, 4 минуты; один цикл 94°C, 20 секунд (денатурация); 65°C, 30 секунд (отжиг); 72°C, 40 секунд (удлинение); два цикла — 94°C, 20 секунд (денатурация); 62°C, 30 секунд (отжиг), 72°C, 40 секунд (удлинение); три цикла — 94°C, 20 секунд (денатурация; 59°C, 30 секунд (отжиг); 72°C, 40 секунд (удлинение); пять циклов — 94°C, 20 секунд (денатурация); 57°C, 40 секунд (отжиг); 72°C, 40 секунд (удлинение); двадцать четыре цикла — 94°C, 20 секунд (денатурация); 55°C, 30 секунд (отжиг); 72°C, 40 секунд (удлинение); а затем окончательное расширение — 72°C, 10 минут в PTC-200 Peltier Thermal Cycler (MJ Research, Watertown, MA). Отрицательный контроль готовили без добавления ДНК. Его включили в каждую ПЦР реакцию для исключения ложноположительных результатов, обусловленные загрязнением. Продукты ПЦР реакции разделяли и визуализировали с помощью электрофореза в 1.2% агарозном геле, окрашенного EtBr, и очищали от фрагментов геля (размеры полос около 700 пар оснований) с помощью QIAquick Gel Extraction Kit (QIAGEN, Valencia,CA).

2.3.2. Клонирование и секвенирование

Очищение SL и IL nosZ ампликоны привязывали к pCR4 TOPO вектору, и вектор с вставкой трансформировали в OneShotTOP10 химически компетентные Escherichia coli клетки, используя TOPO TA Cloning Kit и инструкцию производителя (InvitrogenLife Technologies, Carlsbad, CA). Из каждой библиотеки SL и IL nosZ случайно выбирали 96 клонов и культивировали для получения плазмид. ДНК плазмиды очищали (AgencourtSprintPrep 384 HC Kit, Agencourt Bioscience, Beverly, MA) и секвенировали с помощью генетического анализатора ABI PRISM (Applied Biosystems, Foster City, CA) с T7 и T3 праймерами из набора для клонирования (Invitrogen) в Лаборатории службы Биологического анализа, Института морских и экологических технологий (Baltimore, MD). Последовательности редактировали, собирали, используя ПО Sequencher (Gene Code Corp., Ann Arbor, MI, USA), анализировали с помощью Basic Local Alignment Search Tool (BLASTn; www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST), и сравнивали с имеющимися последовательностями в базе данных GenBank. Таким образом, создавали соседей, связанные филогенетические древа для выбора наиболее близких похожих последовательностей.

2.3.3. Номера доступа к нуклеотидной последовательности

41 частичные nosZ последовательности, которые созданы в данном исследовании, помещены в базу данных GenBank под номерами доступа — KT252910 до KT252950.

3. Результаты и обсуждение

3.1. Фаза 1. Высокая и низкая нагрузка нитратом при постоянном HRT (время гидравлического удержания)

Снижение уровня нитрата отмечено в обоих периодах Фазы 1 (Рисунок 3a). Хотя различия концентраций на входе и на выходе были относительно низкими (Таблица 1: 1.57 ± 0.15 и 1.82 ± 0.32 мг NO₃-N/л для двух периодов, соответственно). Высокий водообмен и компактный объем биофильтра привели к среднему уровню удаления 0.71 ± 0.07 и 0.80 ± 0.15 г N удаленного/(л биореактора в день) для двух периодов, соответственно. Это намного больше, чем ранее отмеченные диапазоны 0.1-0.4 г N/(л в день) для денитрификации с серой (Lampe and Zhang, 1996; Sahinkaya and Kilic,2014; Sahinkaya et al., 2014), но аналогично нижней границе диапазона для песочного биофильтра с псевдоожиженным слоем песка. Christianson и Summerfelt (2014) сообщали, что песок намного дешевле серы при использовании в биофильтре с псевдоожижением субстрата. Песок выгоднее по объемным показателям и площади поверхности субстрата ($70–$200/м³ против >$1000/м³, соответственно; $0.02/м² против ≈$0.30/м², соответственно), хотя песочному биофильтру необходим источник углерода для денитрификации. Нагрузка на входе в Фазу 1 испытательных периодов 1 и 2 составляла 1.46 и 5.82 г N/(л в день), соответственно. Эффективность удаления нитрата составляла 50 ± 4.6% и 16 ± 3.2% для двух периодов Фазы 1, соответственно. Период 1 характеризовался более высокой эффективностью, вследствие низкой концентрации нитрата на входе.

Теоретически, образование сульфата пропорционально выраженности автотрофной денитрификации, т.е. служит наилучшим индикатором протекания этого процесса (Oh et al., 2003; Sahinkaya et al.,2014). Основываясь на уравнении (1) и средних значениях утилизации азота 1.57 и 1.82 мг NO₃-N/л, в периоды 1 и 2 должно образовываться в среднем — 11.8 и 13.7 мг SO42−/л. Однако, в течение этих периодов образовалось лишь 2.7 ± 2.0 и 6.1 ± 1.6 мг SO42−/л. Для периодов 1 и 2 отсутствовали значимые различия концентрации сульфата в поступающем и выходящем потоках (Таблица 1; Рисунок 3b). Это указывает на то, что часть азота удалена в ходе гетеротрофной денитрификации, в дополнении к автотрофной. Как и элементная сера переходит в сульфат, некоторая часть сульфида в растворе также окисляется (Рисунок 3c; Таблица 1; среднее значение удаления 6.19 ± 1.82 и 8.64 ± 1.04 г S2−/л). Sher с коллегами (2008) отмечали, что бассейн перегниватель осадка УЗВ также обеспечивает автотрофную денитрификацию с сульфидом в качестве донора электронов. Двойная функциональность удаления нитрата и сульфида имеет особую значимость для УЗВ, где вода возвращается в бассейн с рыбой, чем для обработки стоков УЗВ.

Другим индикатором протекания автотрофной денитрификации является снижение щелочности. Этот показатель снижался на 16 и 12 мг CaCO₃/л для двух периодов Фазы 1 (Таблица 2). Другие авторы отмечали значительное падение щелочности в исследованиях денитрификации с серой (Koenig and Liu, 1996), и это сложнейший вызов таких систем (Kim and Bae,2000). Естественная щелочность весенних вод, использованных в УЗВ, обладает хорошими буферными свойствами и не требует внесения щелочей. Как отмечал Furumai et al. (1996), оптимальная щелочность для автотрофной денитрификации с серой составляет 150-240 мг/л. Исходя из уравнения (1), удаление 1.57 и 1.82 мг NO₃-N/л должно привести к расходу щелочности — 7.2 и 8.3 мг CaCO₃/л за периоды 1 и 2, соответственно. Кроме того, исходя из степени удаления азота (0.71 и 0.80 г N/(л-день)), расход щелочности должен составлять 3.2 и 3.7 г CaCO₃/л-день для двух периодов. Одновременное протекание гетеротрофной денитрификации снижало расход щелочей скорее, чем повышало его, и, в то время как нитрификация расходует щелочи, концентрация TAN во всем объеме биофильтра меняется не равномерно. Некоторую долю щелочей потребляет процесс разложения осадка в биофильтре, хотя это не проверяли.

Вариабельность стандартных ошибок для показателя щелочности усложняет дальнейший анализ.

Существенные изменения значений pH не происходили. В поступающем и выходящем водном потоках pH варьировал от 7.33 до 7.39 в обоих периодах испытаний (Таблица 2). Другие авторы отмечали значимое снижение pH (Koenigand Liu, 1996; Sahinkaya and Kilic, 2014), с возможным накоплением нитрита при pH ниже 7.4 (Furumai et al., 1996). В данной работе накопление нитрита не происходило, потому что значения pH были лишь слегка ниже в биофильтрах (Таблица 1; Рисунок 4). Температура воды поступающего и выходящего потоков существенно не отличалась, хотя наблюдались сезонные колебания. Максимум температуры отмечен в промежутке 100-150 дня (20.06.2014-09.08.2014), самое жаркое время для запущенного эксперимента (Рисунок 5a). Как ожидалось, концентрация DO на выходе снижалась до менее чем 1.0 мг DO/л, когда колонны работали в плановом режиме (Рисунок 5b), и до менее чем 0.5 мг DO/л в течение обоих тестовых периодов (Таблица 2). Это указывает на сильное влияние аэробных и/или факультативных анаэробных компонентов в биофильтре. Факультативные гетеротрофные денитрификаторы используют свободный кислород в качестве акцептора электронов до тех пор, пока он доступен. Кислород энергетически более предпочтительный акцептор, чем нитрат. Автотрофная денитрификация протекает в аэробных и анаэробных условиях (Zhang and Lampe, 1999). Потенциальное влияние вымывания серы зарегистрировано со 150 дня, когда возросла концентрация DO в выходящем потоке; на 181 и 198 дни вносили дополнительную серу. Окислительно-восстановительный потенциал был всегда отрицательным и очень вариабельным. Он слегка снижался на протяжении периода 1, но возрастал на протяжении периода 2 (Таблица 2; Рисунок 2c). Это возрастание ORP в биофильтрах закономерно, потому что ORP поступающей воды в этот период оказался более восстановленный; качество поступающей воды на протяжении эксперимента изменялось и не контролировалось, вследствие природы стоков данной производственной УЗВ.

Понятие «миксотрофная денитрификация» связано с одновременным протеканием гетеротрофной и автотрофной денитрификации (Oh et al., 2003; Sahinkaya and Kilic, 2014). В условиях относительно высоких значений COD и cBOD₅ в загрязненной воде, вероятно. Происходит миксотрофная денитрификация. Oh с коллегами (2003) отметили, что внесение различных растворимых органических веществ (метанол, этанол, ацетат) не подавляет автотрофную денитрификацию, хотя добавление в избытке органического углерода не снижает образование сульфата. Баланс автотрофных/гетеротрофных реакций может снизить запросы к высокой щелочности со стороны автотрофной денитрификации, потому что гетеротрофы образуют щелочь (Kim and Bae, 2000; Lee et al., 2001; Oh et al., 2003). Так как гетеротрофы растут быстрее автотрофов, в миксотрофном реакторе денитрификации некоторые формы органического углерода утилизируются прежде, чем сера (Sun and Nemati, 2012). Доступность донора электронов может играть роль в этом процессе, так как слабая растворимость частиц серы ограничивает денитрификацию, особенно, при высокой нагрузке N (Kim et al., 2004). Подходящие соотношения COD:NO₃-N для гетеротрофной денитрификации составляют от 3:1 до 6:1 (van Rijn et al., 2006), значения в поступающем потоке 74 ± 7.5 и 7.2 ± 1.3 COD:NO₃-N за период 1 и 2, соответственно, более чем достаточно для питания гетеротрофной денитрификации (cBOD₅:NO₃-N 24 ± 4.9 и 3.3 ± 0.5). Однако в периоды 1 и 2, COD лишь снижался 8.5 ± 19 и 2.4 ± 3.0 мг COD/л, соответственно, и концентрации cBOD₅ – не снижались в биофильтрах (Таблица 1). В соотношении COD:NO₃-N на каждые 5.4 и 1.3 мг потребленного COD утилизировалось 1 мг N для периодов 1 и 2, соответственно. Очень низкое соотношение утилизации в период 2 в отличии от периода 1 потенциально указывает на то, что большая часть N удаляется в ходе автотрофной, а не гетеротрофной денитрификации. Отсутствие детектируемого снижения cBOD₅ говорит о слишком коротком времени гидравлического удержания. Тогда как гетеротрофная денитрификация, вероятно, ответственна за некоторую часть удаления нитрата, внутреннее перемещение твердых частиц может осложнить баланс COD.

3.2. Фаза 1. Микробиологическая характеристика

Секвенирование 96 случайно выбранных клонов от каждой библиотеки nosZ из внешнего слоя биопленки (SL) и внутреннего слоя биопленки раскрыли 14 уникальных таксономических единиц (OTUs) для SL и 9 для IL (Таблица 3).

Процент клонов схожих последовательностей в библиотеке рассчитывали отдельно для SL-nosZ и IL-nosZ (Таблица 3: сверху для SL-nosZ и снизу для IL-nosZ ). Клоны библиотеки nosZ в SL принадлежали к: Alphaproteobacteria (19.6%), Betaproteobacteria (76.5%), и неклассифицированные бактерии (4.3%); в IL принадлежали к: Alphaproteobacteria (2.2%), Betaproteobacteria (17.5%), и неклассифицированные бактерии (80.4%). По аналогии с предыдущими исследованиями денитрификации в биофильтре с псевдоожиженным песочным слоем (Tsukuda et al., 2015), популяции денитрифицирующих бактерий, содержащих nosZ ген, более распространены в SL, чем в IL. В данной работе более 80% IL-nosZ клонов тесно связаны с некультивируемыми бактериальными клонами 2-80 (Accession JF509076.1). Это слабое распространение nosZ может являться результатом более низкой концентрации DO и более высокой доступности серы (донора электронов) в IL. Некультивируемые бактериальные клоны 2-80 также обнаружены в SL биопленке, но % этих клонов был гораздо больше в IL (4.3 против 80.4% в SL против IL, соответственно). Это указывает на существование невыделенных и неидентифицированных автотрофных денитрификаторов, утилизирующих серу.

Состав микробного сообщества указывает на то, что ген ключевого фермента денитрификации (nosZ) в SL, преимущественно, находился у Azoarcus, Thauera и Paracoccus spp., которые известны как гетеротрофные денитрификаторы. Их присутствие свидетельствует о более подходящих геохимических условиях протекания гетеротрофной денитрификации в SL, чем в IL. С другой стороны, последовательности nosZ, принадлежащие Thiobacillus denitrificans, облигатного хемолитоавтотрофного денитрификатора, преобладали в IL денитрифицирующем сообществе. Т.е. IL обеспечивает подходящие условия для автотрофов, хотя их доля была 4.3% IL-nosZ клонов (80.4% составляли неидентифицированные бактериальные клоны 2-80). Оптимальная температура для роста T. denitrificans составила 28-32°C (Shao et al., 2010). Низкая температура воды в эксперименте (13–22°C; Рисунок 5a) может обуславливать слабое развитие этих бактерий. T. denitrificans является первым выделенным и описанным хемолитоавтотрофом. Он способен использовать тиосульфат, тетратионат, тиоцианат, сульфид и молекулярную серу в качестве донора электронов. Это самый часто встречающийся в литературе организм денитрификатор (Park et al.,2010, 2011; Chen et al., 2013; Xu et al., 2014). Обнаружение генов nosZ автотрофных денитрификаторов в IL и SL биопленках убедительно указывает на способность биофильтров с псевдоожиженным слоем серы культивировать и обогащаться автотрофными денитрифицирующими бактериями для удаления нитрата. Это происходит даже при относительно коротком времени гидравлического удержания по сравнению с работами, где использовали реактор с неподвижным слоем серы. Кроме того, совместное существование автотрофных и гетеротрофных денитрификаторов свидетельствует о том, что реактор позволяет культивировать оба типа бактерий, которые представляют уникальное эффективное миксотрофное сообщество для удаления нитрата (Oh et al., 2001).

3.3. Фаза 2. Влияние времени гидравлического удержания на автотрофную денитрификацию

Когда каждый биофильтр работал независимо, удаление N и образование сульфата показали недельный возрастающий тренд при возрастании HRT (Рисунок 6a и b). Основываясь на наклоне прямой регрессии (-0.0405 г N/л*день на литр/мин водного потока), снижение скорости водного потока примерно на 20 л/мин обеспечит дополнительное удаление 0.81 г N/л*день, что эквивалентно удалению 167 г N/день для этих биофильтров. Удаление сульфида также имеет тенденцию к возрастанию при высоком HRT, хотя эта регрессия даже менее строго коррелировала (Рисунок 6a).

Для систем с псевдоожиженным слоем, это снижение скорости водного потока для достижения более длинного HRT является компромиссом в условиях менее сжиженного слоя серы, когда необходимо повысить HRT через весь биофильтр. Рекомендованный уровень подъема субстрата 60% (Christianson and Summerfelt, 2014) требует скорости водного потока 80 л/мин и результирующий HRT лишь 2.5 минуты в данных биофильтрах. Значения HRT у реакторов с неподвижным или непрерывно перемешиваемым слоем серы составляют от 3 до 24 часов (Lampe and Zhang, 1996; Lee et al., 2001; Sahinkaya and Kilic, 2014; Sahinkaya et al., 2014). Koenig и Liu (1996) докладывали, что необходимый уровень HRT для полного удаления N зависит от размера частиц серы. Для 40% удаления нитрата при размере частиц серы 2.8-5.6 мм в упакованном неподвижном слое время гидравлического удержания должно превышать 30 минут. Kimand Bae (2000) докладывал, что при нагрузке 2.2 кг N/м³*день полная денитрификация в неподвижном слое достигается при HRT 2.34 часа. Нагрузка в Фазу 2 находилась в диапазоне 2.7-6.7 кг N/м³ биофильтр*день. Таким образом, для полного удаления N в неподвижном слое необходимы более высокие значения HRT. В одном исследовании с применением псевдоожиженного слоя серы подъем субстрата составлял 25-30%, HRT – 0.19 часа, размер частиц серы – 2-3.35 мм (Kim et al., 2004). В этих условиях, при нагрузке 20 мг NO₃-N/л эффективность удаления составила 90%. Однако, Kim с коллегами (2004) также докладывали о снижении эффективности удаления N, когда нагрузка превышает 2.53 кг N/м³*день, что и наблюдалось в настоящей работе. В идеале, эффективность утилизации нитрата можно улучшить, увеличив длину биофильтров на 2-3 метра или слегка снизить размер частиц серы. Оба предполагаемых нововведения повышают HRT в слое денитрификации.

4. Заключение

Несмотря на прохождение лишь 1.57±0.15 и 1.82±0.32 мг NO₃-N/л через каждый биофильтр в ходе Фазы 1, удаление нитрата было наибольшим для серосодержащих денитрифицирующих систем (0.71±0.07 и 0.80±0.15 г N/л биофильтра*день). Более низкое от ожидаемого образование сульфата указывает на то, что часть нитрата удаляется посредством гетеротрофной денитрификации. Тем не менее, статистически значимого снижения COD и cBOD₅ в выходящем водном потоке по сравнению с поступающим не зафиксировано.

Миксотрофную денитрификацию подтвердили, определив присутствие гетеротрофных и автотрофных денитрификаторов. Фаза 2 эксперимента показал, что удлинение времени удержания приводит к более высокому удалению нитрата и образованию сульфата. Однако манипуляции с водным потоком для увеличения HRT создают проблемы для подъема слоя серы. С течением времени частицы серы разлагаются, поэтому установить баланс скорости псевдоожижения и HRT становится проблематично.
—-
Laura Christianson, Christine Lepine, Scott Tsukuda, Keiko Saito,Steven Summerfelt. Nitrate removal effectiveness of fluidized sulfur-based autotrophicdenitrification biofilters for recirculating aquaculture systems. Aquacultural Engineering 68 (2015) 10–18