Техника для органотипа in vitro культур с бессывороточной питательной средой была проверена с точки зрения её работоспособности в копировании нормального развития зубов у цихлиды Hemichromis bimaculatus и циприниды Danio rerio. Серии полутонких срезов рассматривались при помощи светового микроскопа для сбора данных о форме зубов, а также использовалась просвечивающая электронная микроскопия для сравнения клеточной и экстрацеллюлярных свойств развивающихся зубных зачатков in vitro (в пробирке) с аналогичными in vivo (у животных). Головные экспланты Hemichromis bimaculatus  от 120 часов постэмбрионального развития до 8.5 суток постэмбрионального развития и Danio rerio от 45 часов до 79 часов постэмбрионального развития и взрослых рыб содержались в культуре в  течение 3, 4 или 7 дней, показывая, что развитие зубных зачатков in vitro у эксплантов, в которых щечный или глоточный эпителий был недифференцирован на протяжении всего времени эксплантации развиваются вплоть до стадии прикрепления. В дополнение, отчасти дозволенный морфогенез и дифференцировка клеток зубных зачатков сходны с наблюдаемыми in vivo и установленной зубной моделью (места и ряд появления и прикрепления зубов). Таким образом, органотипичная культура в бессывороточных питательных условиях натолкнула нас на мысль исследовать эпителиально-мезенхимальные взаимодействия во время развития зубов у костных рыб и дать анализ генетическому управлению развития нижнечелюстных или глоточных зубов и перестановку у данных полифиодонтных (имеющих неограниченное количество смены зубов) видов. Важно, что это позволяет головы от погибших эмбриональных мутантов (Danio rerio) или от ранее неудавшихся летальных экспериментов развивать далее, когда нормальный эмбрион уже погибает. Такая органотипичная культура в бессывороточных питательных условиях могла, вследствие этого, стать мощным инструментом в изучении развития и открыть новые перспективы для черепно-лицевых исследований.

Введение

Зубы позвоночных формируются за счет реципрокного взаимодействия между одонтогенным эпителием и нижележащей мезенхимой. Как показано, большое количество генов экспрессируется в течение морфогенеза и дифференцировки зубов млекопитающих. У мышей зуб является автономной единицей, то есть предполагаемые зачатки культивируются в глазе перед стадией развития плакоды и формирования зуба проходит в изоляции от челюсти. Остается рассмотреть, является ли это верным для других позвоночных. Млекопитающие это наиболее часто используемые животные модели для изучения аспектов развития зубов, но они сменяют свои зубы только раз (дифиодонтные) или не происходит у монофиодонтных (крысы, мыши). В противоположность, большинство не относящихся к млекопитающим таксонов сменяют свои зубы в течение всей жизни (полифиодонтные условия). Неизвестен механизм, за счет которого инициируется замена зубов, как у дифиодонтных, так и полифиодонтных видов.

Полифиодонтные условия, обнаруженные у костных рыб, поднимают несколько вопросов. Является ли генетический контроль развития зубов у костистых рыб схожим с известным для млекопитающих? Является данный контроль схожим для развития челюстных и глоточных зубов? Будет ли частота смены, которая характеризует полифиоднотные условия инициироваться по-новому, вовлекая общие молекулярные каскады, отвечающие за активацию образования зубов первого поколения, или смена является результатом обособленных (или усеченных) каскадов? Другими словами, являются ли эпителий и/или мезенхима связанными общей судьбой в развитии всех будущих поколений зубов или только их одного формирования? Некоторые их этих вопросов могли быть объективно адресованы анализу одонтогенеза в стандартизированных условиях in vitro.

Ямада (Yamada) и др. (1980) были первыми описавшими химически полученные в бессывороточной питательной среде  морфогенез и цитодифференцировку зачатков больших коренных зубов мышей в экспериментах in vitro. Зачатки больших коренных зубов, находящиеся на последнем уровне, формировали дентин и эмаль в течение 10 дней культивирования. Таким образом, авторы привели свидетельства того, что не требуется никакая сыворотка, извлеченная их эмбрионального экстракта, для полного развития зубов.

По нашим данным, только две статьи имеют дело с экспериментами in vitro по развитию культур систем органов, особенно, исследований скелетных тканей рыб. Мияке (Miyake) и Хелл (Hall) (1994) установили метод  в культуре in vitro, основанный на питательной среде, содержащей Leibovitz L15 (L-15) и лошадиную или бычью эмбриональную сыворотку, в то время как Коуманс (Koumans) и Сайр (Sire) (1996) разработали бессывороточную питательную среду. Которая позднее имела химические преимущества и оказалась пригодной для изучения скелетных элементов цихлиды Hemichromis bimaculatus и, как положено, использована в нашей работе.

Настоящее исследование имело целью изучить возможность воспроизведения развития зубов (включая этап инициирования, морфогенез, цитодифференцировку и прикрепление) костных рыб в экспериментах in vitro на бессывороточной питательной среде. Оно служит для рассмотрения условий среды на поздней фазе, влияния определенных морфогенов, таких как ростовые факторы, на развитие зубов и их смену. Мы использовали модельный организм, Данио рерио, для которых ранее были собраны данные о росте тела и развитии зубов. Основным недостатком данио рерио в качестве модели в изучении зубов является то, что последние ограничены глоточными челюстями (в связи с жаберными дугами рыбок). Поэтому, мы избрали путь параллельного выполнения эксперимента на культуре in vitro, имеющей как глоточные, так и челюстные зубы, то есть H. Bimaculatus. Подобно данио, морфогенетическая установка зубного ряда у хромиса хорошо изучена. Осведомленность о зубном ряде имеет важное значение для установки и оценки in vitro культур в отношении ответа на некоторые вопросы, озвученные выше.

В данной работе мы культивировали экспланты головы раннего постэмбрионального этапа развития данио рерио и H. Bimaculatus, а также экспланты глоточных челюстей взрослых данио, и сравнивали эти результаты с ситуациями in vivo при использовании световой и просвечивающей электронной микроскопии. Мы показали, что начиная от эксплантов, у которых эпителий является морфологически недифференцированным, зубные зачатки формируются in vitro по одонтогенезу подобно iv vivo и, что зубы прикрепляются к челюстной кости за счет (неминерализированной) кости прикрепления, сформированной in vitro.

Материалы и методы

Материалы

Личинки H. Bimaculatus 120, 136, 144 и 150 часов постэмбрионального развития и 8.5 дневные постэмбриональные (примерно, 200 часов) были получены в качестве лабораторных животных. Икринки содержались при 25 градусах в течение 72 часов. Личинки питались науплиями Артемия и коммерческой стартовой питательной пылью на стадии свободного плавания, то есть 6 дней.

Личинки Данио рерио 45 часов и 79 часов постэмбрионального развития разведены как лабораторные животные и выращены при температуре 27±0.5 градусов (инкубация проходила 48 часов). В дополнение, взрослые животные использовались для эксплантации изолированных глоточных челюстей.

Все образцы умерщвлялись при помощи повышенной дозы анастезии MS222, согласно Бельгийсому закону по защите лабораторных животных. Так как личинки рыбок имели маленькие размеры (длина головы меньше 1 мм), изолирование челюстей в культуру был невозможным. Личинки декапитировались и головы (в случае Данио рерио)или передняя часть головы (в случае H. Bimaculatus) использовались как образцы; у взрослых, глоточные челюсти отделялись от головы.

Рисунок 1. Личинки H. Bimaculatus (А. 6 дней постэмбрионального развития) и Danio rerio (В. 48 часов постэмбрионального развития). Показан уровень, на котором отрезалась голова (штрихпунктирная линия). Стрелками обозначено примерное расположение челюстей ротовой полости (H. Bimaculatus) и глотки (Danio rerio). Шкала калибровки слева – 1 мм (А), 250 мкм (В).

Контрольные образцы одного помета фиксировались на время эксплантации и время фиксации самих эксплатнов. Число образцов, использованных для каждого типа эксперимента и количество в контроле представлены в таблицах 1,2.

Методы

Культуры in vitro готовились согласно процедуре, описанной Коумансом и Сайр (1996). Головные экспланты и изолированные челюсти вначале три раза промывались в течение 3 минут в L-15, затем дважды в течение 3 минут в L-15, содержащим 300 мкг/мл гентамицина (Sigma) и 500 ед/мл нистатина (Sigma; то есть 10 раз нормальной концентрацией) для очистки и предотвращения грибкового и бактериального загрязнения. Позднее образцы вновь ополаскивались приготовленным раствором L-15 (согласно Коуманса и Сайр 1996) и инкубировались при полном погружении в среду L-15 в 6-ти ячеистых блюдцах с культурой тканей (объем, 4 мл среды/ячейка). Блюдца инкубировались при 25-27 градусах в инкубаторе при обычной влажности воздуха. Среда сменялась каждый день. Экспланты содержались в культуре на протяжении 3 или 7 дней В конце периода культивирования они вместе с контрольными пробами фиксировались в смеси параформальдегида и глутаральдегида, и помещались в Epon как описано Хьюзейном (Huysseune) и Сайр (1992). Материал не был декальцинирован. Все экспланты и контрольные образцы были разрезаны на серии срезов (толщиной 1 мкм или 2 мкм), а срезы, в свою очередь, окрашивались толуидиновым синим. Некоторые серии прерывались для ультратонкого разделения. Тонкие (80 нм) срезы окрашивались ацетатом уранила и цитратом свинца и рассматривались под Philips 201 электронным микроскопом, работающий при 80 кВ.

Таблица 1. Эксперименты, выполненные на культурах H. Bimaculatus и результаты эксплантов в количестве зубных зачатков или зубов (t0 время эксплантации, n  количество дней в культуре).
a-число головных эксплантов, помещенных в культуру; b-число контрольных образцов, фиксированных на время эксплантации; c-число зубных зачатков или зубов, наблюдаемых в контроле на время эксплантации (число в скобках показывает разы, когда обнаружены зубные зачатки/зубы от общего количества  проверенных половинок нижних челюстей); d-количество зубных зачатков или зубов, наблюдаемых в эксплантах (число в скобках показывает разы, когда обнаружены зубные зачатки/зубы от общего количества  проверенных половинок нижних челюстей).

Таблица 2. Эксперименты, выполненные на культурах Данио рерио и результаты эксплантов в количестве зубных зачатков или зубов (аббревиатуры и подписи как в таблице 1; половинки нижних челюстей заменены на обособленные глоточные челюсти)

——-

Данный текст является переводом статьи Tooth development in vitro in two teleost fish, the cichlid Hemichromis bimaculatus and the cyprinid Danio rerio. авторов C. Van der heyden . F. Allizard . J.-Y. Sire . A. Huysseune. Cell Tissue Res (2005) 321: 375–389. Опубликованном в сети: 21 June 2005.

Рассказ идет от первого лица, так как это представлено в оригинале.