Использование эндоскопа для определения пола и зрелости яичников Русского осетра

Русский осетр (Acipenser gueldenstaedtii) обитает в Каспийском, Черном и Азовском морях, и уходит на нерест в Волгу, Куру, Дон, Кубань и Днепр. Однако строительство дамб, стартовавшее в 20 веке, блокировало пути миграции и препятствовало нересту осетра. Поэтому большинство особей, вылавливаемых из этих морей, получено в ходе зарыбления рыбой из российских ферм.

В естественной среде самцы Русского осетра достигают половой зрелости к 8-13 годам, а самки к 10-16 годам. Благоприятные условия аквакультуры ускоряют созревание и рост рыбы. Аквакультура в России, подталкиваемая угасанием диких популяций и активизацией промысла, лишь недавно получила развитие. Тем не менее, не хватает информации о развитии гонад и половом развитии Русского осетра, хотя она доступна для других культурных осетров.

Основным продуктом аквакультуры Осетровых рыб является икра, поэтому очень важно разработать методы раннего определения пола. Обычно по достижении товарного размера самцы отправляются на мясной рынок, тогда как самки в течение многих лет выращиваются в культуре. Осетровые рыбы не имеют внешнего полового диморфизма, и отсутствие внешних половых признаков подталкивает к поиску практических методов исследования гонад.

Хотя половая дифференцировка осетров заканчивается к 1-2 году, надежное определение пола Русского осетра невозможно до 3 лет.

У взрослых самок, достигших половой зрелости, информация о развитии ткани яичников важна для успешного производства икры. Следует принять во внимание, что вителлогенез у культивируемых осетров длится до 3-4 лет. Сроки созревания вариабельны среди особей одного возраста. Поэтому, оценка оптимального времени сбора икры требует многократного исследования каждой самки. В данной статье приводятся результаты сравнения эндоскопии и гистологического исследования гонад. Работа направлена на выявление надежного метода анализа половой принадлежности особей и мониторинга развития овариальной ткани Русского осетра.

Материалы и методы

Рыба и условия культивирования

Русский осетр (A. gueldenstaedtii) импортирован и привезен из Азовского моря в мае 1999 года в виде оплодотворенной икры. Рыба выращивалась на ферме “Dan Fish Farms”(Верхняя Галилея, Израиль; 31°30′N, 34°45′E). В течение первого года рыба содержалась в каналах объемом 5 м3 при температуре воды 16°C. По достижении средней массы 500 граммов их перемещали в прямоугольные бетонные бассейны объемом 250-500 м3. Осетр выращивался под открытым небом при температуре 13-16°C зимой и 20-24°C остальную часть года. Он питался дважды в день кормом для форели с гранулой 4 мм (Фабрика комбикормов в Цемахе, Цемах, Израиль; 50% белка, 18% жира). Ежедневный рацион составлял 0.4-1.0% от биомассы, в зависимости от сезона и размера рыб.

Первые 4 года сопровождались умерщвлением 20 случайно выбранных особей в каждой возрастной группе. Проводили биопсию, гистологическое исследование гонад, измеряли массу гонад, определяли пол и стадию развития гонад. К 5 году группа из 80 самок, случайно выбранных из ранее определенных по полу рыб, помещалась в бетонные пруды объемом 40 м3 для дальнейшего мониторинга. Наблюдение велось вплоть до 7-ми летнего возраста, когда наступала половая зрелость. Каждая особь маркировалась цветными, пластиковыми ушными метками для коров, которые крепились к одному из грудных плавников. Один раз в год, весной, развитие гонад рыб исследовали эндоскопом и измеряли массу особей. Кроме того, для мониторинга скорости роста выращивалось 10 самцов, масса которых также ежегодно фиксировалась.

Эндоскопия

Для наблюдения за развитием гонад был сконструирован эндоскоп. Он состоит из 4 мм футляра, длиной 14 см и диаметром 4 мм, с включением оптико-волоконного кабеля, соединенного с холодным галогенным источником света и миниатюрной видеокамерой (Karl Storz, Германия). Эта система позволяет рассматривать внутренние органы рыбы вдоль полости тела и делать фотографии в отдельных точках.

Рисунок 1. Эндоскоп
Рисунок 1. Эндоскоп: A. Наркотизированный осетр в процессе эндоскопического исследования через брюшной разрез. Красная окружность: место разреза. B. Компоненты системы: 4 мм корпус цитоскопа (sc), с миниатюрной видеокамерой (vc), соединенной с галогенным источником холодного света (lf) через оптико-волоконный кабель и контролирующий камеру блок (cc), связанный с монитором (mn).

Каждую рыбу наркотизировали в ванной с раствором гвоздичного масла (0.25 мг/л) и помещали на V-образную столешницу для обследования. На брюшной стенке стерильным скальпелем делали надрез длиной 5-10 мм, куда вставляли корпус цистоскопа. К цистоскопу подключали 5-мл шприц и внутренний канал, через который органы омывали 1-4 миллилитрами фосфатного солевого буфера для лучшего видения. Излишки раствора вытекали из полости вскоре после удаления цистоскопа. После обследования, которое длилось 2 минуты, после чего рыбу переносили в свежую воду для восстановления. Необходимости в наложении шва не было, потому что рана вскоре заживлялась сама. Эндоскопическое исследование применялось для определения развития гонад у самцов и самок. Параллельно, брался биоптат гонад. Биопсию выполняли троакаром с 3х30 мм желобами. Инструмент погружали в яичник через рану. Собирали примерно 270 мг ткани от каждой особи.

Определение пола

Для определения половой принадлежности осетров использовали метод эндоскопии. В целом, за 2 месяца было исследовано 10563 особей Русских осетра в возрасте 3.5 года (в среднем, 400 особей в неделю). Рыбу помещали в бетонные бассейны объемом 20 м3 со свежей водой при температуре 16°C, из которого её вылавливали, проводили наркотизацию и изучали.

Гистологический анализ

Гистология, в общем, выполняли по методике, описанной Hurvitz et al. (2005) и Jackson et al. (2006). Кратко, образцы гонад фиксировали в растворе Боуина на 48 часов, а затем переносили в 70%-раствор этанола для хранения и до последующего микроскопирования. Срезы парафина толщиной 4-7 мкм окрашивали гематоксилином и эозином. Для описания этапов развития гонад адаптировали терминологию Linares-Casenave et al. (2003). Средний диаметр ооцитов рассчитывали для каждой особи после измерения пяти и большего числа ооцитов на фиксированной ткани перед обработкой. Диаметр ооцитов измеряли с использованием оптического бинокуляра со шкалой (CETI Belgium), точностью ±50 мкм.

Статистический анализ

Сравнение отклонения состава полов от ожидаемого соотношения 1:1 определяли с помощью теста Хи-квадрата (95% уровень значимости). ПО Prism 4.02.

Результаты

Определение пола

Зимой 2003 года (октябрь-февраль) с помощью эндоскопа обследовали рыбу, рожденную в 1993 году (масса 4-6 кг). Гонады с крупными, гладкими, желтоватыми долями и беловато-розовой узкой зоной, содержащей мелкие, но видимые полупрозрачные сферы (ооциты) идентифицированы как женские.

Всего исследовано 10563 особи: 5810 (55%) оказались самками, 4225 (40%) – самцами, 528 (5%) – не удалось определить. Соотношение самцов и самок существенно отличалось от ожидаемого 1:1, согласно проведенному тесту Хи-квадрата (p<0.0001). Все особи имели возраст 3.5 года, среднюю массу 5.3±1.5 кг, без внешних отличий между самцами и самками. Не идентифицированные рыбы имели меньший размер и весили 2.5±0.8 кг. Таким образом, мужских особей вскоре пустили на производство мяса, что позволило проверить результаты с непосредственным наблюдением гонад. Среди 800 отправленных особей не было обнаружено самок.

Таблица 1. Сводные данные массы тела и развития гонад особей в возрасте 1-6 лет. В возрасте 1-4 года, самок n = 20, самцов n = 20. В возрасте 5-6 года, самок n = 80, самцов n = 10

Возраст (годы)Масса тела (кг)Стадия развития гонад
СамкиСамцыСамкиСамцы
10.270±0.0840.270±0.084Не дифференцированы
23.335±0.3823.053±0.666ПревителлогенезРанний сперматогенез
34.633±0.5914.217±0.858ПревителлогенезСперматогенез
46.812±1.535.235±1.5ПревителлогенезЗрелость
510.215±2.37.345±1.8ПревителлогенезЗрелость
611.4±3.29.876±2.1Ранний вителлогенезЗрелость

Развитие яичников

Весной 2004 года, когда осетр достиг 5-летнего возраста, он имел массу 10.2±2.3 кг. Рыб исследовали эндоскопом, и все самки имели гонады на стадии превителлогенеза. Весной 2005 года, масса 6-тилетней рыбы составляла 11.4±3.2 кг, у 20% самок присутствовали немногочисленные белые ооциты (начало вителлогенеза). Однако, к 7 году (12.9±3.3 кг) уже 52% самок имели яичники на различной стадии вителлогенеза. Значительная вариабельность развития гонад обнаружена у особей одного возраста. Более того, внутри одного яичника обнаружены ооциты различного диаметра, цвета и стадии развития. С учетом размера самого крупного ооцита в яичнике, который был обнаружен при эндоскопии и определен гистологически, было выделено 5 стадий развития яичников: A. Превителлогенез, B. белые ооциты, C. Желтые ооциты, D. Серые ооциты, E. Черные ооциты.

На стадии превителлогенеза ооциты имели примерно одинаковый размер 400±50 мкм. Первым признаком перехода к следующей стадии является появление белых ооцитов: один или два таких ооцита можно видеть через неподвижный эндоскоп на площади овариальной ткани — 45±5 мм2. Белые ооциты крупнее окружающих их при-вителлогенетических ооцитов. Они имеют четкую белую окраску и часто выдаются над поверхностью овариальной ткани. Количество белых ооцитов различается среди самок.

Стадия желтых ооцитов характеризуется одновременным присутствием при-вителлогенетических, белых и желтых ооцитов. На ранней стадии серых ооцитов все ещё встречаются при-вителлогенетические, белые, желтые ооцитов, и появляются серые клетки. Однако, переход к стадии черных ооцитов происходит лишь после синхронизации, когда в гонаде развиваются однородные серые ооциты. Эта синхронизация сопровождается полным поглощением жировой прослойки гонады. Заключительная стадия отмечена в ходе последнего эндоскопического исследования, проведенного в марте 2006 года, когда осетр достиг возраста 7 лет. Она характеризовалась присутствием серых и черных ооцитов диаметром от 2600 до 3200 мкм. На этом этапе среди крупных фолликулов может наблюдаться формирование новых при-вителлогенетических ооцитов. Распределение этапов развития гонад для 80 самок представлено в таблице 2. Средняя масса рыб в это время составила 12.09±3.3 кг. Не обнаружено значимой корреляции между массой тела и стадией развития гонад (r=0.0225).

Таблица 2. Стадии развития яичников к 7 годам

СтадияМасса самки (кг)Диаметр ооцита (мкм)Окраска икры% самок (n=80)
Превителлогенез12.1±2.5<600Полупрозрачные45
Белые ооциты12.3±4.5800±200Белые30
Желтые ооциты10.5±2.71300±300Белые/желтые13.75
Серые ооциты13.4±3.12100±500Желтые/серые7.5
Черные ооциты12.6±0.53000±400Серые/черные3.75
Рисунок 2. Вид на яичники Русского осетра через эндоскоп
Рисунок 2. Вид на яичники Русского осетра через эндоскоп. A. Ооциты на стадии при-ветеллогенеза (pvo), B. Стадия Белых ооцитов (wo), C. Стадия Желтых ооцитов (yo), D. Стадия Серых ооцитов (go), E. Стадия Черных ооцитов (bo). Масштаб – 1 мм

Гистологический анализ

Яичники 7-милетних самок на стадии превителлогенеза имели широкую зону яйцеобразующих ламелл и узкую зону окружающей жировой прослойки. Ооциты находились на стадии жировой капельки и кортикальной альвеолярной стадии (200 – 480 мкм и 480 – 600 мкм, соответственно), окруженные адипозной тканью (Рисунок 3A). С Белых ооцитов (Рисунок 3B-C) начинается накопление желтка клетками. На этой стадии они крупнее 600 мкм в диаметре, и капельки жира распределены по цитоплазме. По периферии ядра присутствует множество нуклеолей (Рисунок 3B). Внешние мембраны состоят из зоны радиата, где выделяются два слоя – внешний и внутренний. В области базальной пластинки и теки ооцита также присутствуют гранулезные клетки (Рисунок 3C).

Желтые ооциты находятся на стадии среднего вителлогенеза и имеют диаметр 1000-1600 мкм. Жировые гранулы уже распределены повсеместно (Рисунок 3D). Серые ооциты находятся на стадии позднего вителлогенеза, их диаметр 1600-2600 мкм. Цитоплазма изобилует жировыми гранулами, а ядро располагается в центре (Рисунок 3E). Стадия Черных ооцитов включает полностью созревшие клетки, в которых ядра занимают центральное положение или мигрируют к анимальному полюсу. Цитоплазма полна жировыми гранулами, и на гистологических срезах можно видеть желатинообразное покрытие — желточную оболочку (Рисунок 3F).

Рисунок 3. Гистологические срезы яичников Русского осетра
Рисунок 3. Гистологические срезы яичников Русского осетра. A. Ооциты на стадии при-ветеллогенеза (pvo), B. Стадия Белых ооцитов (wo), C. Увеличенные слои оболочки Белого ооцита. D. Стадия Желтых ооцитов (yo), E. Стадия Серых ооцитов, F. Стадия Черных ооцитов. ad – адипозная ткань, zri – внутренняя зона радиата, zre — внешняя зона радиата, gr – гранулезные клетки, tl — тека, bl – базальная пластинка, yg – желточные глобулы, yp – желточные пластинки, n — ядро, nu — нуклеоли, ve – желточная оболочка, ge – желеобразные покрытие.


Обсуждение

Эндоскопия

Описано несколько методов диагностики пола и развития гонад Осетровых рыб. Традиционным и наиболее распространенным является инвазивный метод, когда рыбу наркотизируют и производят 3-4 см разрез на брюшной стороне. Через рану можно рассматривать гонады. После проверки накладывают швы и дезинфицируют раневую поверхность. В случае беременных самок для выполнения биопсии гонад достаточен разрез длиной 1 см. Kynard и Kieffer (2002) описали методику определение пола и зрелости ооцитов с помощью бороскопа, пропускаемого через урогенитальный тракт. Он оказался эффективным на последних стадиях созревания, опасным для половых органов рыб и неэффективным для диагностики незрелых особей. Hernandez-Divers с коллегами (2004) опубликовали метод эндоскопического исследования в определении пола и манипуляций с развитием гонад Остроносого осетра (Acipenser oxyrinchus). Wildhaber с коллегами (2005) провел сравнительный анализ эффективности ультразвуковой диагностики и эндоскопии в определении пола и зрелости осетров. Заключение было ожидаемым: успешность метода была зависела от его инвазивности. Наименее инвазивная ультразвуковая диагностика оказался наименее эффективным. Эндоскоп успешно применяли для определения пола Арктического гольца (Salvelinus alpinus) (Ortenburger et al., 1996 ).

Другим распространенным методом диагностики является биопсия с помощью трокара. Трокар представляет собой острый металлический стержень, шириной 3 мм, с бороздами длиной 50 мм. Он погружается через брюшную стенку в гонаду, и ткань собирается в борозды при вращении. Метод эффективен для изучения зрелых особей, тогда как у молодых рыб часто ошибочно забирается жировая ткань.

Ультразвуковое сканирование Осетровых рыб неинвазивна, обладает 96% точностью определения самцов и 80% — самок (Colombo et al. (2004). Другие авторы приводят цифру точности – 97% (Moghim et al., 2002). Однако использование ультразвуковой диагностики требует высокого опыта для анализа изображений, и работа с молодыми особями снижает точность. С другой стороны, эндоскопия позволяет непосредственно рассматривать ооциты, их цвет, размер и распределение, и делать лучшую оценку развитию гонад. Система 20-кратно увеличивает изображение ткани, в зависимости от близости к ней объектива. Это важное преимущество, особенно для идентификации пола 3.5 годовалых особей, когда ооциты имеют диаметр всего 150-180 мкм и не видны невооруженным глазом.

Определение пола

Осетровые рыбы являются гонохористичными (раздельнополыми) животными. Имеются сведения о гетерогаметности самок Белого осетра (Acipenser transmontanus), бестера ( Huso huso самка х Acipenser ruthenus самоец), Тупорылого осетра (Acipenser brevirostrum).

Гетерогаметность – гаметы особи содержат неодинаковые половые хромосом.

Отмечена типичная для птиц система определения пола – WZ – самки, ZZ – самцы, когда ожидаемое соотношение полов 1:1 справедливо и для Осетровых рыб. Дорошов с коллегами (1997) обнаружил это соотношение среди сотен культивируемых особей Белого осетра. Однако Flynn et al. (2006) докладывал, что нормальные, неотобранные популяции Тупорылого осетра, которые выращивались компанией «Supreme Sturgeon and Caviar» в Канаде, обычно имели сдвиг по полу в сторону самок (56% самок). Аналогично, результаты этой работы показали преобладание самок (55% самок, 40% самцов, 5% неопределенные). Маловероятно, что разница полов у Русского осетра обусловлена какими-либо иными механизмами детерминации пола. Скорее, некоторые факторы среды в интенсивной культуре повышают выживаемость самок.

Развитие гонад

Самцы Русского осетра к 2 годам проходят полную дифференцировку гонад, а к 4-5 годам гонады полностью созревают. Гонады самок на стадии превителлогенеза, вплоть до 5 лет содержат ооциты диаметром 180-400 мкм. Яичник 7-летниъх самок на стадии превителлогенеза (Рисунок 2A и 3A) существенно не отличается от яичника более молодых самок, находящихся на той же стадии. Единственным отличием является более широкая зона яйцеобразующего слоя и более узкая окружающая жировая прослойка. У большинства рыб на этом этапе ооциты на стадии жировой капельки и кортикальной альвеолярной стадии (200-480 мкм и 480-600 мкм, соответственно) присутствовали у самок 4-5 летнего возраста.

Термин «Белый ооцит» дан второй стадии развития гонад, потому что через эндоскоп клетки имеют белую окраску (Рисунок 2B). Гистологически, ооциты находятся на раннем этапе накопления жира, связанным с началом вителлогенеза. Этот этап эквивалентен описанию стадии 5 для бестера (Amiri et al., 1996), стадии C для Белого осетра (Linares-Casenave et al., 2003), стадии C для Калуги (Huso dauricus) и Японского осетра (Acipenser mikadoi) (Omoto et al., 2004).

Термин «Желтый ооцит» присвоено стадии среднего вителлогенеза (Рисунок 2C и 3D), а «Серый ооцит» — стадии позднего вителлогенеза (Рисунок 2D и 3E). Обе стадии вителлогенеза аналогичны тем, которые найдены и для других видов Осетровых рыб, хотя авторы и используют разную терминологию. Например, Linares-Casenave et al. (2003) использовал термин ранний и средний вителлогенез для Белого осетра.

Стадия «Черного ооцита» характеризует миграцию ядра (поздний вителлогенез у Linares-Casenave et al., 2003), и у Русского осетра ооциты имели минимальный диаметр 2.8 мм. На этой этапе их можно собирать на производство икры или после завершения созревания использовать для разведения.

Так как Осетровые рыбы известны синхронизацией развития яичников (Doroshov et al., 1997), было удивительно наблюдать в первом цикле полового созревания Русского осетра асинхронное развитие гонад, вплоть до стадии Серых ооцитов. Предполагается, что как только единичный фолликул в яичнике приступает к вителлогенезу, он продолжает развитие независимо от соседних фолликулов, вплоть до стадии позднего вителлогенеза. Затем его рост останавливается до тех пор, пока другие фолликулы в яичнике не достигнут одного уровня зрелости. Последнюю стадию вителлогенеза они проходят синхронно.

Культурный Белый осетр также демонстрирует асинхронное развитие гонад среди самок. При этом периоды вителлогенеза варьируют от 16-18 месяцев до 3-4 лет (Doroshov et al., 1997). Культурные гибриды (бестер) также обладают вариативностью вителлогенеза среди самок (Amiri et al., 1996). Большинство исследователей определяют степень развития яичников по размеру самых крупных ооцитов, однако отсутствует детальное описание вариативности размера и других характеристик ооцитов в ходе полового развития внутри одного яичника.

Размер тела и стадия развития гонад

В течение 6 лет культивирования, самцы и самки Русского осетра росли с одинаковой скоростью, за исключением 4-года, когда самцы имели меньшую массу, что обусловлено завершением их созревания (Таблица 1). Тем не менее, размеры и масса тела являются вариабельными параметрами, зависят от условий культивирования. Поэтому указанные значения необязательно максимальны для вида A . gueldenstaedtii.

К 7 годам, лишь немногие из 80 самок имели стадию Черного ооцита. Однако 55% из них уже находились на различных стадиях вителлогенеза (Таблица 2). Анализ развития яичников в сравнении с массой тела не показал статистически значимой корреляции этих параметров. Аналогично, отсутствует очевидная связь между массой тела и зрелостью ооцитов у бестера ( Amiri et al., 1996) или культурного Сибирского осетра (A. baeri) (Pelissero et al., 1991). Кроме того, у Белого осетра обнаружена высокая вариабельность размера половозрелых особей в культуре и дикой популяции (Doroshov et al., 1997).

——

Avshalom Hurvitz, Karen Jackson, Gad Degani, Berta Levavi-Sivan. Use of endoscopy for gender and ovarian stage determinations in Russian sturgeon ( Acipenser gueldenstaedtii ) grown in aquaculture. Aquaculture. 270 : 158 – 166. 2007

Оригинал статьи со списком источников:
departments.agri.huji.ac.il/animal/staff/faculty_staff/sivan_berta/publications/19-Hurvitz-etal-2007-aquaculture.pdf

Реакция постоянных читателей:

Заметил ошибку, тык*:

 Orphus

Комментарии Вконтакте:

Использование эндоскопа для определения пола и зрелости яичников Русского осетра: 1 комментарий

  1. Аналогичная методика проверена на стерляди и бестере в работе Сафронова с коллегами. «Использование эндоскопа для ранней прижизненной диагностики пола у Осетровых рыб». ВГУП ВНИРО. Легко ищется в сети.

Добавить комментарий

Войти с помощью: 

Ваш e-mail не будет опубликован. Обязательные поля помечены *