Развитие малька гуппи

Развитие малька гуппи в утробе самки
Развитие зародыша гуппи в условиях in vitro

Мелкие аквариумные рыбки, такие как, данио рерио, японская медака (Oryzias latipes) и гуппи популярные модельные организмы для изучения позвоночных и токсикологических исследований. Кроме того, гуппи (Poecilia reticulata) становится модельным организмом для поведенческих исследований, в частности, ухаживаний и половых предпочтений, генетических работ. Гуппи были первыми рыбками, у которых обнаружен, сцепленный с полом, локус (область гена) окраски (Winge, 1927). Уже на протяжении века внимание генетиков и экологов привлекает богатство цветовых вариаций взрослых самцов гуппи.

Натуралистам гуппи интересны не только потому, что самцы имеют удивительную окраску, но также потому, что самки обладают уникальной способностью к живорождению. Вероятно, читателю будет интересно узнать о некоторых деталях питания зародыша и стадиях его внутриутробного развития.

К сожалению, работы, посвященные раннему развитию живородящих рыб, затруднены, потому что невозможно проводить манипуляции с эмбрионом. Поэтому, в отличие от классических генетических исследований с наблюдениями за окраской гуппи, данные об онтогенезе этих рыбок скудны. Для изучения раннего развития эмбриона необходимо оптимизировать условия культивирования in vitro, что позволит создать адекватные условия наблюдения.

Гуппи относится к семейству Пецилиевых, включающему живородящие виды. Оплодотворенная икра остается в фолликулах в течение беременности (Turner, 1940; Lambert, 1970). Синхронно развивающиеся ооциты на фазе диплотены, перед тем, как окончательно созреть и быть оплодотворенными, накапливают питательные вещества в гранулах желтка.


Диплотена – стадия развития половых клеток. Четвертая стадия первой профазы мейоза, характеризующаяся возникновением отталкивания гомологичных хромосом друг от друга.


Сплетение портальной системы сосудов желтка, принадлежащему плоду, и фолликула беременной самки гуппи, образуя, так называемую, фолликулярную псевдоплаценту, позволяет эффективно совершать газообмен и удалять продукты метаболизма. После оплодотворения, развивающийся эмбрион питается своими запасами и не нуждается в питании от матери (Turner, 1940; Thibault & Schultz, 1978).

Строго говоря, гуппи является яйцеживородящим видом, потому что эмбрион имеет относительно много желтка и питается своими запасами. Истинные живородящие виды, такие как млекопитающие, на этапе антенатального развития имеют мало собственного желтка и питаются от организма матери через плаценту.

Интересно отметить, что отсутствие истинной плаценты, однако, не мешает самкам некоторых видов Пецилиевых обеспечивать своим эмбрионам не только газообмен, но также доступ питательных веществ. В исследовании Резника с коллегами (Reznick et al., 2002) оценивалась масса мальков после рождения. Было показано, что у видов Poeciliopsis turrubarensis и Poeciliopsis infans мальки имели индекс матротрофии при рождении 0.6-0.7, тогда как у видов Poeciliopsis presidionis и Poeciliopsis prolifica он приближался к 1.00.


Матротрофия (экстраэмбриональное питание) – процесс прямого переноса питательных веществ от матери развивающемуся зародышу. Индекс матротрофии сравнивает сухую массу малька при рождении с массой оплодотворенной икринки. Чем больше индекс, тем выше взаимодействие матери и плода.


Таким образом, исследователи продемонстрировали, что потомство видов Poeciliopsis turrubarensis и Poeciliopsis infans при рождении практически не отличается по массе от икромечущих рыб, тогда как индекс матротрофии Poeciliopsis presidionis и Poeciliopsis prolifica говорит об активном питании эмбриона из кровеносного русла матери. Т.е. личинки Poeciliopsis presidionis и Poeciliopsis prolifica являются матротрофными.

У беременных самок гуппи истинная плацента отсутствует, и их личинки являются лецитотрофными, т.е. питаются за счёт запасов питательных веществ (желтка), содержащихся в самом яйце, не потребляя никакое другое питание (Reznick et al., 2002). Это дает возможность проводить экстракорпоральное культивирование. Ulrike с коллегами (2006) ранее проводил продолжительное культивирование эмбрионов гуппи, но не мог успешно завершить его. Авторы работы отметили, что некоторые особи развиваются в условиях in vitro дольше, чем в утробе матери. Поэтому искусственная среда, сама по себе, не является ограничивающим фактором развития.

Позднее, в исследования Ulrike Martyn, с коллегами (Ulrike Martyn et al., 2006), LiLi Liu с коллегами (LiLi Liu et al., 2014) для оптимизации условий культивирования была подобрана необходимая концентрация фетальной бычьей сыворотки.

Исследователи смогли провести продленное культивирование эмбрионов гуппи и зарегистрировать все стадии развития.

Протокол культивирования
Для получения эмбрионов брались самки гуппи, которые содержались в лабораторных условиях при температуре 25°C и 12 часовом дне. Рыбки наркотизировались 0.035% раствором MS-222 (Этил-3-аминобензойной кислоты метансульфонат) или 0.05% MABA (мета — аминобензойной кислоты этиловый эфир метансульфонат) и декапитировались. Острыми ножницами открывался доступ к брюшной полости, из которой извлекались яичники. Яичники помещали в солевой 90% фосфатный буфер, и из них под микроскопом забирались эмбрионы. Если зародыш имел остатки фолликула, то перед культивирование фолликул удалялся.

Эмбрионы помещались по 15 штук в 8 мл стерильной среды (L-15 [Leibovitz] [GIBCO, cat. no. 11415-064]. Оптимизированная среда для продленного культивирования зародышей гуппи содержала – 10% фетальной бычьей сыворотки [LiLi Liu et al., 2014]. Состав антибиотиков в среде был следующим: 20 единиц/мл пенициллина и 200 мг/мл стрептомицина [LiLi Liu et al., 2014], либо 70 единиц/мл пенициллина и 70 мг/мл стрептомицина [Ulrike Martyn et al., 2006]. В инкубаторе отсутствовало освещение, и температура составляла 25°C.

Наблюдения за развитием зародышей гуппи

Внутриутробное развитие малька гуппи
Рисунок 1. Нормальное внутриутробное развитие гуппи (P. reticulata). Незрелые ооциты (A), икра (B), эмбрионы (C–K) гуппи обозначены справа, а слева иллюстрация эмбриона Gambusia affinis (Haynes, 1995). A: незрелые бледные ооциты и на стадии вителлогенеза (с желтком). B: зрелая икринка. C: бластодиск располагается в верхнем полюсе икринки. D: эмбриональный щиток с примитивной полоской. E: стадия оптического колпачка. F: стадия раннего глаза (сверху). G: стадия среднего глаза . H-I: стадия позднего глаза . K: малек гуппи перед рождением. На F и G, передние и латеральные компоненты показаны. На H и I, фолликулярная стенка, желточная оболочка и желток удалены. Масштаб 500 мкм (A–G), 1 мм H–K. [Ulrike Martyn, Detlef Weigel, Christine Dreyer. In Vitro Culture of Embryos of the Guppy, Poecilia reticulate. Developmental Dynamics. 235 : 617–622, 2006]

Дней после родов – развитие извлеченных из самки эмбрионов отсчитывается в днях от последних родов этой самки.


Первая иллюстрация на фотографии 1 представляет незрелые ооциты на этапе вителлогенеза. На стадии 3 развития зрелый ооцит содержит жировые гранулы, которые распределены по поверхности желтка. После оплодотворения жировые гранулы сливаются и располагаются под эмбрионом, который формирует бластодиск (стадия 4). В ходе 5 стадии видная примитивная полоска на диске. На стадии 6 формирования зрительного колпачка глаза остаются непигментированными, в нижней части желточного мешка видны кровеносные сосуды портальной системы, сердце выглядит как пульсирующая трубка. На стадии 7 появления глаза появляется светло-коричневая пигментация радужки, сначала в верхней передней области, а затем по всей радужке. На этой стадии меланофоры не видны на голове и туловище. На стадии раннего глаза — пигментированные глаза, включая сосудистую оболочку, увеличиваются в размерах, появляются отростки брюшных плавников. Мускулатура сомитов и несомитов дифференцируется.


Меланофоры — пигментные клетки с черным пигментом меланином.


Дальнейшая классификация на стадии среднего, позднего глаза основывается на прогрессивной дифференцировке глаз, которая проходит параллельно с окрашиванием кожи на голове и теле. На стадии среднего глаза эмбрион имеет полностью окрашенные глаза. На стадии позднего глаза – сосуды покрывают большую часть сетчатки, а лучи спинного, брюшных и хвостового плавников дифференцированы. Сегментированная мускулатура образуется из примерно 30 сомитов (H на рисунке 1).


Осевая мускулатура рыбки изначально формируется из сегментированных параксиальных (с каждой стороны от оси и вдоль неё) участков мезодермы, сомитов, которые, в свою очередь, дают начало миотомам (предшественники мышц). Сомит также дает начало – склеротому (предшественник позвоночника и костей) и дерматому (предшественник дермы).


На стадии среднего глаза меланофоры вначале возникают выше среднего мозга, а позднее позади сочленения среднего и заднего мозга (G на рисунке). На этапе позднего глаза черная полоса пигментных клеток разграничивает горизонтальную срединную линию. Наиболее острые черные пигментные клетки на голове увеличиваются в размере, становятся древовидными, и их количество также возрастает. Различные части тела эмбриона покрыты меланофорами различной формы. Более того, появляются парные дорсальные и вентральные окрашенные полосы. За ними следуют вторая, тусклая горизонтальная полоса меланофоров выше и параллельно срединной линии. Окрашивание тела незаметно вплоть до стадии очень позднего глаза, когда между дорсальной и вентральной полосами меланофоров появляется рисунок из ромбовидных меланофоров. Этот рисунок постепенно развивается от переднего верхнего конца к задней брюшной области тела (I на рисунке 1). Меланофоры и иридофоры накапливаются на боковых участках оболочки, покрывающей желток. На наиболее поздней стадии развития глаз иридофоры также дифференцируются на сосудистой оболочке глаз (I,K на рисунке 1).

Одновременно с исчезновением желтка практически прямой угол между головой и туловищем постепенно выпрямляется (H-K на рисунке 1). Зрелый эмбрион полностью утрачивает запасы желточного мешка. Наконец, перед появлением малька гуппи на свет, рвется оболочка фолликула (K на рисунке 1).

Развитие малька гуппи в утробе самки
Рисунок 2. Развитие зародыша гуппи в условиях in vitro A–U: Эмбрионы на стадии бластодиска (A). Стадия оптического колпачка (сердце начинает биться) (C). День 3-6 активное развитие портальной системы сосудов желточного мешка. День 4 — начало пигментации глаз. День 7 и 8 — появление пигментации на голове. День 13 — иридофоры появляются на сосудистой оболочке глаз. День 21-23 — меланофоры появляются на хвосте и на хвостовом плавнике. Спустя 23 дня все ещё остается большое количество желтка. В искусственных условиях развитие было замедленно. Масштаб — 500 мкм [Ulrike Martyn, Detlef Weigel, Christine Dreyer. In Vitro Culture of Embryos of the Guppy, Poecilia reticulate. Developmental Dynamics. 235 : 617–622, 2006]

——
Reznick D.N, Mateos M, Springer M.S. Independent origins and rapid evolution of the placenta in the fish genus Poeciliopsis. Science. 298 (5595) : 1018-20. 2002
Ulrike Martyn, Detlef Weigel, Christine Dreyer. In Vitro Culture of Embryos of the Guppy, Poecilia reticulate. Developmental Dynamics. 235 : 617–622, 2006 http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/dvdy.20664/pdf
LiLi Liu, Ki-Young Lee. Studies of In Vitro Embryo Culture of Guppy (Poecilia reticulata). Development & Reproduction. 18 (3) : 139-143. 2014

Реакция постоянных читателей:

Заметил ошибку, тык*:

 Orphus

Комментарии Вконтакте:

Добавить комментарий

Войти с помощью: 

Ваш e-mail не будет опубликован. Обязательные поля помечены *