Мелкие аквариумные рыбки, такие как, данио рерио, японская медака (Oryzias latipes) и гуппи популярные модельные организмы для изучения позвоночных и токсикологических исследований. Кроме того, гуппи (Poecilia reticulata) становится модельным организмом для поведенческих исследований, в частности, ухаживаний и половых предпочтений, генетических работ. Гуппи были первыми рыбками, у которых обнаружен, сцепленный с полом, локус (область гена) окраски (Winge, 1927). Уже на протяжении века внимание генетиков и экологов привлекает богатство цветовых вариаций взрослых самцов гуппи.

Натуралистам гуппи интересны не только потому, что самцы имеют удивительную окраску, но также потому, что самки обладают уникальной способностью к живорождению. Вероятно, читателю будет интересно узнать о некоторых деталях питания зародыша и стадиях его внутриутробного развития.

К сожалению, работы, посвященные раннему развитию живородящих рыб, затруднены, потому что невозможно проводить манипуляции с эмбрионом. Поэтому, в отличие от классических генетических исследований с наблюдениями за окраской гуппи, данные об онтогенезе этих рыбок скудны. Для изучения раннего развития эмбриона необходимо оптимизировать условия культивирования in vitro, что позволит создать адекватные условия наблюдения.

Гуппи относится к семейству Пецилиевых, включающему живородящие виды. Оплодотворенная икра остается в фолликулах в течение беременности (Turner, 1940; Lambert, 1970). Синхронно развивающиеся ооциты на фазе диплотены, перед тем, как окончательно созреть и быть оплодотворенными, накапливают питательные вещества в гранулах желтка.

---

Диплотена – стадия развития половых клеток. Четвертая стадия первой профазы мейоза, характеризующаяся возникновением отталкивания гомологичных хромосом друг от друга.

---

Сплетение портальной системы сосудов желтка, принадлежащему плоду, и фолликула беременной самки гуппи, образуя, так называемую, фолликулярную псевдоплаценту, позволяет эффективно совершать газообмен и удалять продукты метаболизма. После оплодотворения, развивающийся эмбрион питается своими запасами и не нуждается в питании от матери (Turner, 1940; Thibault & Schultz, 1978).

Строго говоря, гуппи является яйцеживородящим видом, потому что эмбрион имеет относительно много желтка и питается своими запасами. Истинные живородящие виды, такие как млекопитающие, на этапе антенатального развития имеют мало собственного желтка и питаются от организма матери через плаценту.

Интересно отметить, что отсутствие истинной плаценты, однако, не мешает самкам некоторых видов Пецилиевых обеспечивать своим эмбрионам не только газообмен, но также доступ питательных веществ. В исследовании Резника с коллегами (Reznick et al., 2002) оценивалась масса мальков после рождения. Было показано, что у видов Poeciliopsis turrubarensis и Poeciliopsis infans мальки имели индекс матротрофии при рождении 0.6-0.7, тогда как у видов Poeciliopsis presidionis и Poeciliopsis prolifica он приближался к 1.00.

---

Матротрофия (экстраэмбриональное питание) – процесс прямого переноса питательных веществ от матери развивающемуся зародышу. Индекс матротрофии сравнивает сухую массу малька при рождении с массой оплодотворенной икринки. Чем больше индекс, тем выше взаимодействие матери и плода.

---

Таким образом, исследователи продемонстрировали, что потомство видов Poeciliopsis turrubarensis и Poeciliopsis infans при рождении практически не отличается по массе от икромечущих рыб, тогда как индекс матротрофии Poeciliopsis presidionis и Poeciliopsis prolifica говорит об активном питании эмбриона из кровеносного русла матери. Т.е. личинки Poeciliopsis presidionis и Poeciliopsis prolifica являются матротрофными.

У беременных самок гуппи истинная плацента отсутствует, и их личинки являются лецитотрофными, т.е. питаются за счёт запасов питательных веществ (желтка), содержащихся в самом яйце, не потребляя никакое другое питание (Reznick et al., 2002). Это дает возможность проводить экстракорпоральное культивирование. Ulrike с коллегами (2006) ранее проводил продолжительное культивирование эмбрионов гуппи, но не мог успешно завершить его. Авторы работы отметили, что некоторые особи развиваются в условиях in vitro дольше, чем в утробе матери. Поэтому искусственная среда, сама по себе, не является ограничивающим фактором развития.

Позднее, в исследования Ulrike Martyn, с коллегами (Ulrike Martyn et al., 2006), LiLi Liu с коллегами (LiLi Liu et al., 2014) для оптимизации условий культивирования была подобрана необходимая концентрация фетальной бычьей сыворотки.

Исследователи смогли провести продленное культивирование эмбрионов гуппи и зарегистрировать все стадии развития.

Протокол культивирования
Для получения эмбрионов брались самки гуппи, которые содержались в лабораторных условиях при температуре 25°C и 12 часовом дне. Рыбки наркотизировались 0.035% раствором MS-222 (Этил-3-аминобензойной кислоты метансульфонат) или 0.05% MABA (мета — аминобензойной кислоты этиловый эфир метансульфонат) и декапитировались. Острыми ножницами открывался доступ к брюшной полости, из которой извлекались яичники. Яичники помещали в солевой 90% фосфатный буфер, и из них под микроскопом забирались эмбрионы. Если зародыш имел остатки фолликула, то перед культивирование фолликул удалялся.

Эмбрионы помещались по 15 штук в 8 мл стерильной среды (L-15 [Leibovitz] [GIBCO, cat. no. 11415-064]. Оптимизированная среда для продленного культивирования зародышей гуппи содержала – 10% фетальной бычьей сыворотки [LiLi Liu et al., 2014]. Состав антибиотиков в среде был следующим: 20 единиц/мл пенициллина и 200 мг/мл стрептомицина [LiLi Liu et al., 2014], либо 70 единиц/мл пенициллина и 70 мг/мл стрептомицина [Ulrike Martyn et al., 2006]. В инкубаторе отсутствовало освещение, и температура составляла 25°C.

Наблюдения за развитием зародышей гуппи

---

Дней после родов – развитие извлеченных из самки эмбрионов отсчитывается в днях от последних родов этой самки.

---

Первая иллюстрация на фотографии 1 представляет незрелые ооциты на этапе вителлогенеза. На стадии 3 развития зрелый ооцит содержит жировые гранулы, которые распределены по поверхности желтка. После оплодотворения жировые гранулы сливаются и располагаются под эмбрионом, который формирует бластодиск (стадия 4). В ходе 5 стадии видная примитивная полоска на диске. На стадии 6 формирования зрительного колпачка глаза остаются непигментированными, в нижней части желточного мешка видны кровеносные сосуды портальной системы, сердце выглядит как пульсирующая трубка. На стадии 7 появления глаза появляется светло-коричневая пигментация радужки, сначала в верхней передней области, а затем по всей радужке. На этой стадии меланофоры не видны на голове и туловище. На стадии раннего глаза — пигментированные глаза, включая сосудистую оболочку, увеличиваются в размерах, появляются отростки брюшных плавников. Мускулатура сомитов и несомитов дифференцируется.

---

Меланофоры — пигментные клетки с черным пигментом меланином.

---

Дальнейшая классификация на стадии среднего, позднего глаза основывается на прогрессивной дифференцировке глаз, которая проходит параллельно с окрашиванием кожи на голове и теле. На стадии среднего глаза эмбрион имеет полностью окрашенные глаза. На стадии позднего глаза – сосуды покрывают большую часть сетчатки, а лучи спинного, брюшных и хвостового плавников дифференцированы. Сегментированная мускулатура образуется из примерно 30 сомитов (H на рисунке 1).

---

Осевая мускулатура рыбки изначально формируется из сегментированных параксиальных (с каждой стороны от оси и вдоль неё) участков мезодермы, сомитов, которые, в свою очередь, дают начало миотомам (предшественники мышц). Сомит также дает начало – склеротому (предшественник позвоночника и костей) и дерматому (предшественник дермы).

---

На стадии среднего глаза меланофоры вначале возникают выше среднего мозга, а позднее позади сочленения среднего и заднего мозга (G на рисунке). На этапе позднего глаза черная полоса пигментных клеток разграничивает горизонтальную срединную линию. Наиболее острые черные пигментные клетки на голове увеличиваются в размере, становятся древовидными, и их количество также возрастает. Различные части тела эмбриона покрыты меланофорами различной формы. Более того, появляются парные дорсальные и вентральные окрашенные полосы. За ними следуют вторая, тусклая горизонтальная полоса меланофоров выше и параллельно срединной линии. Окрашивание тела незаметно вплоть до стадии очень позднего глаза, когда между дорсальной и вентральной полосами меланофоров появляется рисунок из ромбовидных меланофоров. Этот рисунок постепенно развивается от переднего верхнего конца к задней брюшной области тела (I на рисунке 1). Меланофоры и иридофоры накапливаются на боковых участках оболочки, покрывающей желток. На наиболее поздней стадии развития глаз иридофоры также дифференцируются на сосудистой оболочке глаз (I,K на рисунке 1).

Одновременно с исчезновением желтка практически прямой угол между головой и туловищем постепенно выпрямляется (H-K на рисунке 1). Зрелый эмбрион полностью утрачивает запасы желточного мешка. Наконец, перед появлением малька гуппи на свет, рвется оболочка фолликула (K на рисунке 1).

——
Reznick D.N, Mateos M, Springer M.S. Independent origins and rapid evolution of the placenta in the fish genus Poeciliopsis. Science. 298 (5595) : 1018-20. 2002
Ulrike Martyn, Detlef Weigel, Christine Dreyer. In Vitro Culture of Embryos of the Guppy, Poecilia reticulate. Developmental Dynamics. 235 : 617–622, 2006 https://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/dvdy.20664/pdf
LiLi Liu, Ki-Young Lee. Studies of In Vitro Embryo Culture of Guppy (Poecilia reticulata). Development & Reproduction. 18 (3) : 139-143. 2014