Супер-самцы (YY) тиляпии

15 нильских тиляпий по 400 граммов (14 месяцев)
15 нильских тиляпий по 400 граммов (14 месяцев; илл. fishandworms)

Нильская тиляпия Oreochromis niloticus (Linnaeus, 1758) является одним из наиболее значимых объектов рыбоводства (FAO, 2005; Nonglak et al., 2012). В коммерческом секторе нагул тиляпии до рыночного размера главная проблема. Рыба начинает размножаться в пруду, вызывая укрупнение популяции и повышая разброс особей по размеру и массе (Mair et al., 1997; Jiménez & Arredondo, 2000; Tariq-Ezaz et al., 2004). Кроме того, самки растут медленнее самцов и позже достигают рыночного размера. Однако рыбоводы, к моменту сбора, стремятся получить рыбу одного размера, поэтому уже на протяжении многих лет выращивание односамцовых популяций является эффективной и востребованной технологией (Vera-Cruz et al., 1996; Mair et al., 1997; Jiménez & Arredondo, 2000; Müller & Hörstgen, 2007).

Чаще всего для смены пола используется гормональная обработка. Однако этот метод подвергается критике. Накопление гормонов в окружающей среде, и возрастание числа потребителей, которые не желают питаться обработанной рыбой (Piferrer, 2001; Müller & Hörstgen, 2007; Leet et al., 2011), заставляют искать альтернативные технологии трансформации пола. Одной из них является получение генетических самцов тиляпии (GMT) за счет скрещивания YY-самцов с XX-самками (Vera-Cruz et al., 1996; Mair et al., 1997).

Слева корзинка, где самцы и самки тиляпии перемешаны, а справа - находятся только самцы (илл.  Centre for Environment, Fisheries and Aquaculture Science )
Слева корзинка, где самцы и самки тиляпии перемешаны, а справа — находятся только самцы (илл.Centre for Environment, Fisheries and Aquaculture Science )

О генотипе YY
Существование самцов, гомозиготных по Y хромосоме, отмечено в 1958 году у медаки (Oryzias latipes). Японский исследователь Ямамото получил YY супер-самцов, используя гормоны и селективное скрещивание. Позднее, YY-особи были получены у гуппи (Poecilia reticulate, Yamamoto, 1963), золотой рыбки (Carassius auratus, Yamamoto, 1975) и тиляпии (Oreochromis niloticus и O.mossambicus, Varadaraj & Pandian, 1989).

Опубликовано несколько работ с YY-самцами различных видов, хотя их выживаемость очень низкая. Например, супер-самцы вида Salmo gairdneri доживают только до стадии появления «глаза» в икринке (Johnstone et al., 1979). Таким образом, возможность получить жизнеспособных самцов лосося с таким генотипом спорна (Calhoun & Shelton, 1983). В своей статье, Pandian и Sheela (1995) заключили, что наличие более одной Y-хромосомы в генотипе самца или самки снижает их жизнеспособность. Однако Mair с коллегами (1997) отмечал схожую с нормальными XY-самцами плодовитость и выживаемость супер-самцов нильской тиляпии (O. niloticus). Позднее, он продемонстрировал выгоду от выращивания в крупных масштабах односамцовых популяций. Для изменения пола исследователь использовал генетические манипуляции. Именно он впервые описал пошаговое руководство получения YY-самцов нильской тиляпии.

Технология
Технология получения YY-самцов тиляпии включает серии этапов феминизации с изучением потомства на расщепление по половой принадлежности. Программа получения YY-мужские особей вида O. niloticus предложена на основе активного изучения генетики половой детерминации у тиляпий. Работа проходила в Университетском колледже Уэльса (Суонси, Великобритания). Её результаты показали, что представители данного вида имеют преимущественно монофакториальную генотипическую систему с гетерогаметностью самцов (XY) и гомогаметностью самок (XX) (Penman et al., 1987; Mair et al., 1990).

Монофакториальный генотипический – находящийся под влиянием одного фактора — гена.

Эта монофакториальная гипотеза, однако, не объясняет некоторые расхождения от прогнозируемого соотношения полов. Возможно, это вызвано флуктуациями средовых факторов, например, температуры (Mair et al., 1990; Trombka & Avtalion, 1993). С другой стороны, влияние температуры на половую детерминацию не объясняет присутствие небольшого числа самцов в поколении предполагаемых самок, выращенных при нормальной температуре. Не исключено, что эти расхождения вызваны аутосомными или полифакториальными генетическими факторами.

Протокол Майера для получения супер-самцов тиляпии:
1. Феминизация потомства от скрещивания нормальных родителей (о гормонах написано ниже). На этапе феминизации пол мальков нельзя определить. Эта процедура успешно проводится с представителями вида O. niloticus и другими видами Oreochromis;
2. Определение трансформированных самок (XY) с помощью проверки её потомства. Так как морфологические, поведенческие особенности и особенности кариотипа этой самки не отличаются от её генетических сестер, остается лишь проверка по менделевскому расщеплению пола у следующего поколения. Для этого, самку скрещивают с нормальным самцом и наблюдают расщепление по полу 3:1 (1XX:2XY:1YY);
3. Скрещивают всех определенных в пункте 2 трансформированных самок (XY) с нормальными самцами (XY). В поколении у 25% особей получается интересный генотип – YY. От каждой самки (XY) получают потомство для дальнейшего исследования поколений;
4. Определение супер-самцов YY. Самцов (2XY и 1YY), полученных в пункте 2, скрещивают с нормальными самками (XX). Потомство от самцов (YY) будет состоять только из самцов. Хотя эта процедура позволяет определить особей с генотипом YY, она непрактична для крупного предприятия. Поэтому важно было, чтобы успешно завершились следующие этапы программы;
5. Проводится скрещивание самцов (YY) с ранее определенными самками (XY), полученными после обработки эстрогеном. Появляется поколение с двумя генотипами – XY и YY. Потомство делится на две группа, одна из которой подвергается феминизации;
6. Проводится проверка поколений для обработанных эстрогеном самок (XY и YY) и необработанных самцов (YY). Предполагается, что в отсутствии различий трансформации XY и YY генотипов, 50% всех трансформированных самок будут иметь генотип YY. Проверка поколений при скрещивании самок с нормальными самцами (XY) должна показать, что от самок (XY) появляются мальки с генотипами (1XX 2XY 1YY), т.е. три самца на одну самку, а от самок (YY) – появляются практически только самцы. На практике, сложно провести статистическое отличие полового состава потомков от этих контрольных скрещиваний. Для облегчения задачи нормальные самки (XX) подвергаются маскулинизации андрогенами и превращаются в самцов (XX). Скрещивание этих самцов с самками XY и YY дает расщепление признака 1:1 и 1:0, соответственно;
7. Для выращивания самцов (YY) в большом количестве, без необходимости проведения проверки поколений, необходимо изучить потомство от скрещивания самцов (YY) с самками (YY);
8. Скрещивание самцов (YY) с самками (YY) приводит к появлению только самцов (YY). Для создания будущего маточного стада необходима феминизация потомства (YY).

Методы феминизации

Легче всего изменить пол рыбок с помощью орального введения эстрогенов и андрогенов. На этапе половой дифференцировки, в течение 14 (Srisakultiew, 1993) — 30 (Alvendia — Casauay and Carino, 1988) дней после вылупления, в корм малькам добавляются гормоны. Кормление осуществляется четыре раза в день. Протокол феминизации оптимизирован группой исследователей, Rosenstein с Hulata (1994) и Mair с Santiago (1994). Он предполагает в течение 20 дней кормить мальков сухим кормом, содержащим 1000 мг/кг диэтилстильбэстрола (DES).

Сравнительно недавно была предложена феминизация выводка, состоящего из супер-самцов YY, под действием теплового шока. Выдерживание мальков (YY) в течение 21 дня при температуре 36ºC приводило к появлению 34% самок YY (32% после обработки DES) (Karayücel I. et al., 2003). Однако смертность была высокой (62.6% против 97%).

Другие протоколы феминизации представлены в таблице (Abdel-Fattah M. El-Sayed. Tilapia Culture):

ВидГормонВведениеДозаВремяПрод-ть% самок
O.nEEванна170-200 мг/лмальки18 дней100
DESкорм4008.7 мм28 дней80
EE1007-12 мм40 дней91
O.mDES10 dph11 дней100
EEна стадии желточного мешка10 дней
EE
EE+methallibмальки42 дней95
EE100-20040 дней93-98
O.sEE1009 мм42 дней92

Виды: Oreochromis niloticus, O.mossambicus, O.spilurus. dph — дней после вылупления; EE — 17α-этинилэстрадиол; DES — диэтилстильбэстрола.

Для маскулинизации (Guerrero III and Guerrero 1988 и Vera Cruz and Mair 1994) рыбок кормят в течение 25 дней рационом, содержащим 17α-метилтестостерона. Затем молодь пересаживается для подращивания в садки.

Другие протоколы маскулинизации представлены в таблице (Abdel-Fattah M. El-Sayed. Tilapia Culture):

ВидГормонВведениеДозаВремяПрод-ть% самцовРемарка
O.nFкорм200-5007 dph30 дней92.5-96генетические самки
Fкорм75-100мальки100
ETкорм60мальки25-28 дней91-99.4
MTкорм30мальки21 день99
MTкорм6010.4 мм14-28 дней82-92
TBAванны250 мг/л10 dpf2 часа98-1002 часа обработки ультразвуком
ANванны100-250 мг/л92
MTванны50 мг/л98
MDHTванны250 мг/л98-100
MTкорм6010-30 dpf92
MTванны500 мг/л10 и 13 dpf3 часаа87
MDHTванны83-100
MDHTванны1800 мг/л14 dpf4 часа100одно погружение
MTванны10 и 14 dpf98.3два погружения
ETванны14 dpf86.7
O.mMDHTванны5-10 мг/л10 dpf10 дней100
MTкорм3018 дней98
ETкорм609-11 dpf100
O.aMIванны0.6 млн-19-11 мм35 дней82
MTкорм509 мм42 дня100
ETкорм60мальки25-28 дней83-97
TBAкорм259.1 мм28 дней98.3
O.sMTкорм70мальки38 дней90
MTванны2.5 млн-1личинки на стадии желточного мешка4 дня100В солоноватой воде, затем в корм добавлялось 50 мг/кг
MT
красная тиляпия11β-OHA4корм5010 dpf28 дней99.1
O.n * O.aтамоксифенкорм1009 мм42 дня100
O.n * O.aETкорм60мальки25-28 дней96-100

Виды: Oreochromis niloticus, O.mossambicus, O.aureus, O.spilurus. dpf — дней после оплодотворения; dph — дней после вылупления; F — флутамид; ET — 17α-этинилтестостерон; MT — 17α-метинилтестостерон; TBA — тренболон ацетат; AN — андростендион; MDHT — 17α-метилдегидротестостерон; MI — метилизотиазолинон; 11β-OHA4 — 11β-гидроксиандростенедион; тамоксифен

Техника проведения проверки поколений

Для проведения этого теста половозрелых тиляпий (150-200 дней) сажают на нерест в садки площадью 1 м2, погруженные в земляные пруды глубиной 60 см. Посадка осуществляется парами, либо по три самки на одного самца. Садки проверяются каждые 7 дней, икра и мальки собираются у инкубирующих самок. Затем самцы и самки родители маркируются пассивными интегрированными ретрансляторами (метки Passive Integrated Transponder) и помещаются в общий бетонный бассейн. Икринки и мальки инкубируются искусственно до момента, пока у них не рассосется желточный мешок. Затем они помещаются группами от одного родителя в садки с мелкой сеткой. Потомство выращивается примерно три месяца, пока они не достигнут массы 3 грамма. После этого их умерщвляют и по осмотру гонад определяют пол (техника размягчения Guerrero and Shelton, 1974. Описание метода — http://om.ciheam.org/om/pdf/b63/00800919.pdf http://www.scielo.br/pdf/cr/v32n1/a23v32n1.pdf ). В больших выводках необязательно умерщвлять всех особей. Достаточно взять наугад 100 особей, избегая предвзятости в выборе по размеру.

На фотографиях снизу представлена ткань семенников и яичников мальков в возрасте 20-60 дней после вылупления. Масса рыбок 0.25-2.0 грамма, длина 26-53 мм. Половую принадлежность уже можно диагностировать.

Тестикулярная ткань самцов Нильской тиляпии
Тестикулярная ткань самцов Нильской тиляпии. Окраска ацетокармином. A, C и E: окрашенная ткань; B, D и F: таже ткань, но неокрашенная (масштаб 400Х). Cys, цисты; Sc, сперматоциты; Sp: сперматогонии (www.scielo.br/pdf/cr/v32n1/a23v32n1.pdf).
Овариальная ткань самок Нильской тиляпии
Овариальная ткань самок Нильской тиляпии. A, C и E: окрашивание ацетокармином. B, D и F: таже ткань без окрашивания (масштаб 400Х). На всех препаратах можно определить ооциты на перинуклеарной стадии. Стрелками указаны нуклеоли.

Особенности половой системы супер-самцов (YY)

Специалисты из Филиппин провели сравнение развития половой системы самцов тиляпий, имеющих нормальный гетерозиготный генотип (XY) и гомозитный (YY). В работе использовались нильские тиляпии вариации Египет-Суонси, полученные в программе «Исследования генетики рыб». Особи выращивалась в Центре Пресноводной аквакультуры государственного университета Центрального Лусона (провинция Нуэва-Эсиха, Филиппины). Анализ тканей проводился в Исследовательском институте естественных наук, Университет Филиппинс, (город Кесон-Сити, Филиппины).

В ходе развития примордиальные (зачаточные) герминальные клетки развивались у обоих типов самцов в одно время, т.е. к 8 дню после вылупления. Эти клетки были крупнее у YY-особей (1.85 против 0.9 мк) и к 9-22 дню закладывали зачатки гонад. У YY-самцов раньше формировались семенниковые доли, к 15 дню. Росток (бластема) половых путей появлялся у YY-особей к 23 дню, а у XY-особей к 27 дню. К 79 дню у обеих групп отмечалось множество делящихся мейозом клеток. К 95 дню полностью дифференцированные семенники YY-самцов содержали зрелые сперматозоиды, тогда как у XY-самцов созревание длилось 105 дней. Супер-самцы имели более крупные семенники, с более толстой соматической тканью, больше сперматогенных клеток, и их половая система развивалась раньше. Размер герминальных клеток и размер их ядра не отличались у обоих типов самцов.

——
http://fishgen.com/YYSEXDET-CJF1.PDF
http://ag.arizona.edu/oip/ista6/ista6web/pdf/104.pdf

Здесь находится скрытый текст. Для его просмотра необходимо зарегистрироваться.

Реакция постоянных читателей:

Заметил ошибку, тык*:

 Orphus

Комментарии Вконтакте:

Добавить комментарий

Войти с помощью: 

Ваш e-mail не будет опубликован. Обязательные поля помечены *