Диагноз является маркером клинического состояния или заболевания, определяемого по признакам, симптомам, и ставится на основе различных процедур диагностики. Термин «диагностические критерии» включает совокупность признаков, симптомов и результатов анализов, которые позволяют клиницисту поставить соответствующий диагноз. Согласно им, он заключает, что «определено заболевание или его внешние признаки и симптомы» или «проанализированы физиологические/биохимические причины, лежащие в основе заболевания и клинических состояний». Диагностика связана с проведением различных процедур, используемых для выявления природы заболевания и точной характеристики первичного и вторичного патогенных организмов. Правильный диагноз обуславливает адекватное лечение и предотвращает чрезмерное использование химиотерапии. Проведение диагностики составляет часть мониторинга состояния аквакультуры. Во время анализа необходимо внимательно ознакомиться с данными об имеющихся ранее заболеваниях.

Значение анамнеза

История болезни крайне важна для постановки правильного диагноза и принятия надлежащих мер по устранению заболевания. Во время вспышки инфекции, аккуратное изучение анамнеза поможет точно определить обстоятельства, при которых она развилась. К числу рассматриваемых аспектов истории болезни относятся: качество воды, количество вносимого корма, количество съедаемого корма, расписание оплодотворений, время последней вспышки развития водорослей, подробности внесения извести, детали проведения лечения, источник посадочного материала и детали зарыбления.

Классификация методов диагностики
1. Микроскопия
2. Гистологическое исследование
3. Биохимическое исследование
4. Иммунологическое исследование
5. Молекулярное исследование

Методы диагностики на присутствие патогенов у водных организмов совершенствуются от описания морфологии путем микроскопии до молекулярного анализа. Молекулярные методы исследования все больше внедряются в практику изучения заболеваний рыб. Полное секвенирование генома патогенных микроорганизмов позволяет продвинуться в изучение их биологии, и улучшить результаты диагностики и профилактики. Использование нуклеиновых кислот в качестве объекта исследования, а также новых методов анализа полиморфизма этих кислот, улучшает избирательность, чувствительность и скорость диагностики. Оно дает возможность связывать особенности генотипа и фенотипа различных патогенных микроорганизмов. Поэтому молекулярная биология может стать обычным инструментом диагностики и контроля инфекций рыб.

Микроскопия

Без проведения микроскопического исследования невозможно провести различия между инфекционной природой заболевания или проблемами с качеством воды. Микроскопия является одним из основных инструментов диагностики заболевания. При должном уровне клинициста и качества оборудования она может осуществляться быстро, но аккуратно. Большинство препаратов предварительно окрашиваются, чтобы выделить патогенные организмы на общем фоне. Тем не менее, неокрашенные нефиксированные образцы пригодны для определения грибков, паразитов (включая яйца гельминтов и личинок) и подвижных организмов. Гибки легче рассматривать после обработки препарата 10%-раствором гидроксида калия (KOH), который растворяет окружающие ткани и негрибковые микроорганизмы.

Как правило, окрашивание основывается на возможных патогенных организмах, однако оно не специфично на 100%. Большинство образцов обрабатываются по Граму, а, если имеются подозрения на микобактерий, то по Цилю-Нильсену (краска для окрашивания кислотоустойчивых бактерий). Но некоторых микроорганизмов сложно разглядеть при использовании данных методов, поэтому приходится прибегать к другим методам определения. В случае подозрения на плохо различимые патогены микроскопическое исследование оказывается бесполезным, потому что необходима минимальная концентрация бактерий 1 x 10⁵/мл.

Обычно применяется световая и электронная микроскопия

Световая микроскопия является наиболее распространенным методом диагностики заболевания. В данном случае непосредственно рассматривается соскоб ткани рыб, либо предварительно приготовленный образец из измельченного органа. Она также используется для изучения гистологических препаратов или окрашенных микроорганизмов.

Электронная микроскопия делится на два основных типа:
1. Просвечивающая (трансмиссионная) электронная микроскопия. Под большим увеличением изучаются изменения в тканях.
2. Сканирующая (растровая) электронная микроскопия. Под большим увеличением изучаются изменения на поверхности тканей.

Гистологические исследования

Гистология является ветвью биологии, в которой проводится микроскопическое изучение тонких, окрашенных срезов ткани. Рассматриваются структура, функции и, в случае гистопатологии, определяются изменения, произошедшие при воздействии патогена и заболевания. Гистологии отводится центральная роль в диагностики заболевания. Окрашенная ткань рыб готовится и исследуется с помощью световой микроскопии. Фиксируются изменения, произошедшие от действия инфекционных и неинфекционных агентов. Для определения некоторых патогенных микроорганизмов также используются иммуногистохимические исследования.

Приготовление срезов

После взятия ткань помещается в водный фиксирующий раствор. Фиксатор сохраняет структуру и химические компоненты тканей и клеток, поэтому их можно обрабатывать дальше, без сопутствующих изменений морфологических особенностей. Очень важно фиксировать ткань быстро после смерти для того, чтобы исключить разрушение тканей и клеток при воздействии их собственных ферментов. После фиксации ткань обезвоживается при воздействии серии растворов этилового спирта. Затем она «ополаскивается» раствором, смешивающимся со спиртом и включениями. Наконец, ткань помещается в расплавленный парафин и охлаждается. После затвердевания с помощью микротом можно готовить гистологические срезы. Перед окрашивание парафин удаляется из среза.

Окрашивание

После ополаскивания и обезвоживания срезы ткани можно окрасить биологическими красителями. Чаще всего гистологические срезы окрашивают раствором гематоксилина с эозином, который раскрывает многие тканевые компоненты. Окраска по Граму необходима для дифференцировки микроорганизмов. Она основана на способности клеточной стенки бактерий задерживать кристаллы метилвиолета после обработки. Клеточная стенка грамположительных бактерий остается фиолетовой, потому что по сравнению с грамотрицательными бактериями она включает много пептидогликанов (сахаров) и мало липидов. Для определения некоторых углеводов, присутствующих в тканях, и идентификации инфекционных грибов у рыб используется реакция Шифф-иодная кислота (ШИК). Области, окрашенные ШИК, выглядят розовыми/красноватыми.

Иммуногистохимия

Методы иммуногистохимиического окрашивания разработаны для определения вирусов, например, инфекционного панкреатического некроза (IPNV), инфекционной анемии атлантического лосося (ISAV) и нодавирусов в фиксированной в парафине ткани. К антигенным структурам вируса, прикрепляются антитела, специально созданные против данного вируса, а затем комплекс «антиген-антитело» с помощью окрашенных продуктов становится виден через световой микроскоп.

Гистологическая техника позволяет описать патологию тканей и выделить последовательность клеточных изменений после воздействия инфекционных и неинфекционных агентов. Исследование окрашенных препаратов, в том числе с использованием иммуногистохимических красителей, позволяет обнаружить и идентифицировать вирусы, бактерии, грибы и паразиты. Усовершенствование и активное вовлечение методов распознавания образов (Facial recognition system) дает возможность получать более точные сведения и, соответственно, улучшать результаты диагностики.

Микробиологическая диагностика

Бактериальные инфекции можно идентифицировать при помощи различных микробиологических методов. Образцы берутся у рыб в нестерильных условиях, культивируются в неселективной среде, а затем проводится диагностика. Используются следующие микробиологические методы:
1. Окрашивание
2. Тест подвижности
3. Культивирование в селективной среде
4. Биохимический тест

Методы окрашивания

Для идентификации различных бактериальных патогенных микроорганизмов используются разнообразные методы окрашивания. Среди них наиболее важным и наиболее распространенным является окрашивание по Граму.

Окрашивание по Граму позволяет дифференцировать бактерии по способности некоторых из них удерживать метилвиолет (грамположительные — синие) и отсутствию этой способности у других (грамотрицательные — красные). Данный метод также подчеркивает морфологию (кокки, бациллы) и построения клеток (двухклеточные, цепи или скопления). Полученные характеристики могут непосредственно повлиять на тип антибактериальной терапии. Для проведения окрашивания по Граму образцы фиксируют высушиванием и последовательно окрашивают кристаллическим фиолетовым (метилвиолет), затем фиксируют раствором йода, осветлителем и контрастным красителем (обычно сафранином).

Окрашивание по Цилю-Нильсену, либо модифицированное окрашивание используется для диагностики кислотоустойчивых (Mycobacterium sp) и умеренно кислотоустойчивых (Nocardia sp) организмов. Метод пригоден для окрашивания видов Rhodococcus и родственных родов, а также ооцитов некоторых паразитов (Cryptosporidium).

Флуоресцентное окрашивание позволяет определить микроорганизмы при их концентрации (1 х 104 клеток/мл). Используются растворы акридинового оранжевого (бактерии и грибы), аурамина-родамина и аурамина О (микобактерии), и калькофлуора белого (грибы, особенно дерматофиты). Совмещение флуоресцентного красителя с антителами против патогенных организмов (прямая или опосредованная иммунофлуоресценция) теоретически повышает чувствительность и специфичность. Тем не менее, данный анализ сложен для чтения и интерпретации. Кроме того, на рынке имеется немного тестов (прямые флуоресцентные тесты с антителами на обнаружение представителей рода Pneumocystis и Legionella).
Окрашивание тушью (коллоидный углерод) используется для определения преимущественно инкапсулированных грибов в клеточной взвеси. Окрашивается, по большей части, фон, тогда как капсула вокруг микроорганизмов видна как ореол. Лейкоциты могут выглядеть инкапсулированными.

Окрашивание по Райту и Романовскому-Гимзе применяется для обнаружения паразитов в крови, фагоцитов и тканевых клеток, внутриклеточных включений, сформированных вирусами и некоторыми бактериями.

Трихромное окрашивание и окрашивание железным гематоксилином предназначены для определения кишечных простейших. Трихромное окрашивание используется для обнаружения микроспоридий, однако может упустить яйца гельминтов и личинок. Железным гематоксилином окрашивают различные типы клеток, клеточные включения и ядра. Яйца гельминтов выглядят слишком темными после железного гематоксилина и хорошо видны.

Тесты подвижности

Гистологические исследования позволяют описать патологию тканей и осветить последовательность изменений, происходящих в клетках при посредничестве инфекционных и неинфекционных агентов.

Существует три метода рассмотрения подвижности бактерий
1. Метод висящей капли
2. Метод культивирования клеток в полутвердом агаре
3. Метод трех покровных стекол

Метод висящей капли

В центр покровного стекла помещают небольшую каплю жидкой культуры бактерий.
В каждый угол покровного стекла капают две мелкие капли воды.
Перевернутое предметное стекло с центральным вдавлением накладывают на покровное стекло. Покровное стекло прилипает к предметному и, когда предметное стекло переворачивают, капля с культурой бактерии принимает подвешенное состояние.
Исследование подвижных организмов проводят при увеличении х400.
Стоит отметить, что, если отсутствуют предметные стекла с вдавлением, можно использовать обычные предметные стекла с кольцом из вазелина или пластилина.
Положительный результат: резкие, зигзагообразные, кувыркающиеся и прочие организованные движения.
Отрицательный результат: отсутствие движений или лишь Броуновское движение.

Метод культивирования клеток в полутвердом агаре

Проводят посев методом укола в агар, находящийся в стеклянной пробирке.
Инкубируют культуру при оптимальной температуре в течение 18-24 часов.
Пересеивают вторичную субкультуру с поверхностного слоя среды.
Положительный эффект: организм обнаруживается на поверхностном слое среды.
Отрицательный эффект: организм остается во внутри пробирки.

Метод трех покровных стекол

Располагают предметное стекло, как показано на рисунке ниже.

Помещают небольшую каплю с культурой бактерий в центр третьего покровного стекла.
Помещают небольшую каплю воды в каждый угол покровного стекла.
Переворачивают предметное стекло и накладывают его на покровное.
После возвращения предметного стекла в исходное состояние капля с культурой бактерий нависает в просвете, образованном двумя другими покровными стеклами.
Исследуют образец при увеличении х400.
Положительный результат: резкие, зигзагообразные, кувыркающиеся и прочие организованные движения.
Отрицательный результат: отсутствие движений или лишь Броуновское движение.

Культивирование болезнетворных бактерий в селективной среде

Ряд бактерий способны развиваться в селективной среде. Это используется для выявления бактериального патогена. Лишь определенные виды бактерий могут расти в селективной среде. Например, представители рода Vibrios культивируются на среде TCBS.

——
[user]по материалам: Arun Sudhagar S, Ezhil Nilavan S, Linga Prabu D, Rathi Bhuvaneswari G, Chandrasekar S and Rajesh kumar R. Diagnostic Tools Used in Fish Disease Diagnosis. Central Institute of Fisheries Education, Mumbai
aquafind.com/articles/FishDiseaseDiagnosis.php

K Riji John & Rosalind George, 2004, Fin Fish & Shell Fish Diseases (Practical Manual). Fisheries College & Research Institute, Thoothukudi.
S Felix, Riji John, Prince Jeyaseelan & V Sundararaj, 2001, National Traning Course On Fish Disease Diagnosis & Health Management, Fisheries College & Research Institute, Thoothukudi.
K M Shankar & C V Mohan, 2002, Fish And Shellfish Health Management, College Of Fisheries, Mangalore.
Ilhan Altinok & Ilknur Kurt, 2004, Molecular Diagnosis Of Fish Diseases: A Review, Turkish Journal Of Fisheries And Aquatic Sciences 3: 131-138
National Standard Methods, Center For Infection, Wales.
Erlich, H.A. PCR Technology Principles And Applications For DNA Amplification. Stockton Press, New York, 1989.
PCR Technology: Current Innovations, 2nd Edition. Edited By Thomas Weissensteiner Et Al.
Edawards K., Logan J., Saunders N. (Eds.). 2004. Real-Time PCR: An Essential Guide. Horizon Bioscience, Norfolk, UK, P. 346.
Durand S.V., Lightner D.V. 2002. Quantitative Real Time PCR For The Measurement Of White Spot Syndrome Virus In Shrimp. J. Fish Dis. 25, 381-389.
La Fauce K.A., Layton R., Owens L. 2007. Taqman Real-Time PCR For Detection Of Hepatopancreatic Parvovirus From Australia. J. Virol. Methods, 140, (1-2), 10-16.
Mouillesseaux K.P., Klimpel K.R., Dhar A.K. 2003. Improvement In The Specificity And Sensitivity Of Detection For The Taura Syndrome Virus And Yellow Head Virus Of Penaeid Shrimp By Increasing The Amplicon Size In SYBR Green Real-Time RT-PCR. J. Virol. Methods, 111 (2), 121-127.
Rajendran K.V., Jeff A. Cowley, Russell J. Mcculloch, Peter J. Walker. 2006. A Taqman Real-Time RT-PCR For Quantifying Mourilyan Virus Infection Levels In Penaeid Shrimp Tissues. J. Virol. Methods 137, 265-271.
Tang K.F., Wang J., Lightner D.V. 2004. Quantification Of Taura Syndrome Virus By Real-Time RT-PCR With A Taqman Assay. J. Viro. Methods 11, 109-114.
[/user]