Реакции антиген-антитело высокоспецифичные и обладают высокой чувствительностью. Они лежат в основе иммунодиагностики. Данный метод позволяет качественно и количественно оценить патогенные организмы и/или защитные антитела. Он может применяться в рыбоводческих хозяйствах без какого-либо инструментария. Очевидно, традиционные методы диагностики сводятся к микроскопии и визуальной оценке. Они требуют большого опыта идентификации микроорганизмов, морфология которых в жизненном цикле зачастую сильно варьирует. Поэтому эволюция диагностики заболеваний в аквакультуре движется в сторону активного вовлечения иммунологических исследований. Данный подход превосходит традиционные методы, потому что обеспечивает идентификацию суб-клинических/латентных/переносимых форм инфекции и четко разграничивает специфику антигенов. Дальнейшее совершенствование иммунодиагностики приведет к развитию моноклональных антител, что повысит точность определения и позволит изучать патогенез заболеваний. Не смотря на это, специфичность антител также ограничивает их применение, потому что большинство антигенов не сохраняются неизменными в течение всей жизни одного патогенного организма (Bartholomew et al., 1995). Хотя существует ряд поликлональных и моноклональных антител для базовой диагностики водных животных.

Реакции преципитации (РП) в агарозном геле

В данном тесте антител и вероятный антиген помещаются в лунки агарозного слоя и смешиваются. Антитело вносится в центральную лунку, а антигены (специфичные или неспецифичные) в краевые лунки. Когда антитело и антиген смешиваются в достаточных количествах, в осадке формируется белая линия между двумя ямками. Она называется линией преципитации.

Тест на агглютинацию

Данный тест используется для определения неизвестных антигенов. Кровь, содержащая неизвестный антиген, смешивается с известным антителом. По присутствию или отсутствию агглютинации определяется антиген. Метод находит применение в подборе донорской ткани, групп крови и диагностике. В прямом тесте на агглютинацию, сыворотка вводится в суспензию клеток, которые проверяются на присутствие на их поверхности собственных антигенов. Если сыворотка содержит специфичные аутоантитела, то при соответствующей их концентрации иммуноглобулины связываются, и клетка становится пересеченной тяжами. Это приводит к агглютинации, и на дне образуется матовая пленка из клеток. Прикрепленные к родительским клеткам аутоантитела, могут обнаруживаться при помощи дополнительного второго антитела. Селективные растворимые собственные антигены также могут анализироваться с помощью аутоантител, прикрепленных к поверхности красных кровяных телец. данный метод называется пассивной непрямой гемоагглютинацией.

ELISA (Иммуноферментный анализ)

Целью проведения теста ELISA является определение присутствия или отсутствия определенного белка в образце и его количественная оценка. Существует два способа реализации теста. В одном из них определяется количество антител в образце, а в другом – количество белка, связанного антителами. Их различие заключается в том, хочет ли исследователь подсчитать антитела, либо какой-либо другой белок. В данном случае рассмотрен вариант ELISA для расчета конкретного антитела в образце крови. Тест ELISA выполняется в 96-ячеистых чашках, с помощью которых можно получить высокую точность. Дно каждой лунки покрыто белком, с которым будет связываться анализируемое антитело. Крови позволяют свернуться, и клетки центрифугируют до появления прозрачной сыворотки с антителами (первичные антитела). Сыворотка инкубируется в лунках, в каждой из которых её тип различен. В 96 лунках располагаются сыворотки для позитивного и негативного контроля. Через некоторое время сыворотка удаляется, и слабо прикрепленные антитела вымываются сериями буферных растворов. Для определения связанных антител в каждую лунку вносятся вторичные антитела. Они обычно производятся у кроликов и связываются со всеми человеческими антителами. К вторичному антителу крепится фермент, пероксидаза или щелочная фосфатаза. Он метаболизирует неокрашенные вещества (хромагены) в окрашенные продукты. После инкубации раствор с вторичным антителом удаляется, и потерявшие липкость единичные молекулы также вымываются. Финальный этап включает добавление фермента с образование окрашенных продуктов в лунках со связанными вторичными антителами. Когда ферментативная реакция завершена, чашку помещают в (сканирующий) спектрофотометр для прочтения планшетов, и для каждой лунки определяется оптическая плотность (т.е. количество окрашенного продукта). Эта плотность будет пропорциональна количеству первичных антител, связанных с белками на дне лунки.

Dot ELISA

Dot-ELISA (Иммуноферментный анализ) активно используемый иммунологический инструмент, как в научной работе, так и в аналитической/диагностической лаборатории. В этом анализе антиген располагается в сэндвиче, непосредственно между двумя антителами, которые реагируют с двумя различными эпитопами одного антигена. Одно из антител иммобилизовано на жесткую основу, а второе связано с ферментом. В образце антиген сначала реагирует с иммобилизованным антителом, а затем с фермент-связанным. Количество фермента у связанного с антигеном антитела оценивают после инкубации полосы с соответствующим количеством хромагенного вещества, которое переходит в нерастворимы окрашенный продукт. Окончательные участники в полосе в области ферментативной активности получили название Dot-ELISA. Ферментативная активность оценивается по интенсивности пятна, которая пропорциональна концентрации антигена.

Тест на агглютинацию с помощью латексных шариков

Тест на агглютинацию с латексными шариками относится к лабораторным методам проверки наличия определенных антител или антигенов в жидкостях организма, например, слюне, моче, спинномозговой жидкости или крови. Антитело или антиген прикреплен к поверхности латексной частицы, именуемой активированным латексом. Когда образец, содержащий специфический антиген или антитело смешивается с молочного цвета латексными частицами, происходит агглютинация.

Флуоресцентный тест с антителами

В этом лабораторном методе для определения присутствия микроорганизмов используют антитела, меченные флуоресцентной меткой. Он позволяет непосредственно наблюдать антигенные структуры за счет флуоресцентного индикации комплексов антиген-антитело. Так как целью метода является обнаружение антигенов в субстрате образцов пациента (клеточный мазок, жидкость или культуральная среда на основе клеток пациента) прямая реакция флюоресцирующих антител редко оценивается количественно.
——
[user]по материалам: Arun Sudhagar S, Ezhil Nilavan S, Linga Prabu D, Rathi Bhuvaneswari G, Chandrasekar S and Rajesh kumar R. Diagnostic Tools Used in Fish Disease Diagnosis. Central Institute of Fisheries Education, Mumbai
aquafind.com/articles/FishDiseaseDiagnosis.php

K Riji John & Rosalind George, 2004, Fin Fish & Shell Fish Diseases (Practical Manual). Fisheries College & Research Institute, Thoothukudi.
S Felix, Riji John, Prince Jeyaseelan & V Sundararaj, 2001, National Traning Course On Fish Disease Diagnosis & Health Management, Fisheries College & Research Institute, Thoothukudi.
K M Shankar & C V Mohan, 2002, Fish And Shellfish Health Management, College Of Fisheries, Mangalore.
Ilhan Altinok & Ilknur Kurt, 2004, Molecular Diagnosis Of Fish Diseases: A Review, Turkish Journal Of Fisheries And Aquatic Sciences 3: 131-138
National Standard Methods, Center For Infection, Wales.
Erlich, H.A. PCR Technology Principles And Applications For DNA Amplification. Stockton Press, New York, 1989.
PCR Technology: Current Innovations, 2nd Edition. Edited By Thomas Weissensteiner Et Al.
Edawards K., Logan J., Saunders N. (Eds.). 2004. Real-Time PCR: An Essential Guide. Horizon Bioscience, Norfolk, UK, P. 346.
Durand S.V., Lightner D.V. 2002. Quantitative Real Time PCR For The Measurement Of White Spot Syndrome Virus In Shrimp. J. Fish Dis. 25, 381-389.
La Fauce K.A., Layton R., Owens L. 2007. Taqman Real-Time PCR For Detection Of Hepatopancreatic Parvovirus From Australia. J. Virol. Methods, 140, (1-2), 10-16.
Mouillesseaux K.P., Klimpel K.R., Dhar A.K. 2003. Improvement In The Specificity And Sensitivity Of Detection For The Taura Syndrome Virus And Yellow Head Virus Of Penaeid Shrimp By Increasing The Amplicon Size In SYBR Green Real-Time RT-PCR. J. Virol. Methods, 111 (2), 121-127.
Rajendran K.V., Jeff A. Cowley, Russell J. Mcculloch, Peter J. Walker. 2006. A Taqman Real-Time RT-PCR For Quantifying Mourilyan Virus Infection Levels In Penaeid Shrimp Tissues. J. Virol. Methods 137, 265-271.
Tang K.F., Wang J., Lightner D.V. 2004. Quantification Of Taura Syndrome Virus By Real-Time RT-PCR With A Taqman Assay. J. Viro. Methods 11, 109-114.
[/user]