Средства диагностики заболеваний рыб. Иммунологическая диагностика

Реакции антиген-антитело высокоспецифичные и обладают высокой чувствительностью. Они лежат в основе иммунодиагностики. Данный метод позволяет качественно и количественно оценить патогенные организмы и/или защитные антитела. Он может применяться в рыбоводческих хозяйствах без какого-либо инструментария. Очевидно, традиционные методы диагностики сводятся к микроскопии и визуальной оценке. Они требуют большого опыта идентификации микроорганизмов, морфология которых в жизненном цикле зачастую сильно варьирует. Поэтому эволюция диагностики заболеваний в аквакультуре движется в сторону активного вовлечения иммунологических исследований. Данный подход превосходит традиционные методы, потому что обеспечивает идентификацию суб-клинических/латентных/переносимых форм инфекции и четко разграничивает специфику антигенов. Дальнейшее совершенствование иммунодиагностики приведет к развитию моноклональных антител, что повысит точность определения и позволит изучать патогенез заболеваний. Не смотря на это, специфичность антител также ограничивает их применение, потому что большинство антигенов не сохраняются неизменными в течение всей жизни одного патогенного организма (Bartholomew et al., 1995). Хотя существует ряд поликлональных и моноклональных антител для базовой диагностики водных животных.

1. Реакции преципитации ( РП ) в агарозном геле.
2. Тест на агглютинацию.
3. ELISA.
4. Dot ELISA.
5. Тест агглютинации с латексными шариками.
6. Флуоресцентный тест на антитела.

Реакции преципитации (РП) в агарозном геле
В данном тесте антител и вероятный антиген помещаются в лунки агарозного слоя и смешиваются. Антитело вносится в центральную лунку, а антигены (специфичные или неспецифичные) в краевые лунки. Когда антитело и антиген смешиваются в достаточных количествах, в осадке формируется белая линия между двумя ямками. Она называется линией преципитации.

Тест на агглютинацию
Данный тест используется для определения неизвестных антигенов. Кровь, содержащая неизвестный антиген, смешивается с известным антителом. По присутствию или отсутствию агглютинации определяется антиген. Метод находит применение в подборе донорской ткани, групп крови и диагностике. В прямом тесте на агглютинацию, сыворотка вводится в суспензию клеток, которые проверяются на присутствие на их поверхности собственных антигенов. Если сыворотка содержит специфичные аутоантитела, то при соответствующей их концентрации иммуноглобулины связываются, и клетка становится пересеченной тяжами. Это приводит к агглютинации, и на дне образуется матовая пленка из клеток. Прикрепленные к родительским клеткам аутоантитела, могут обнаруживаться при помощи дополнительного второго антитела. Селективные растворимые собственные антигены также могут анализироваться с помощью аутоантител, прикрепленных к поверхности красных кровяных телец. данный метод называется пассивной непрямой гемоагглютинацией.

ELISA (Иммуноферментный анализ)
Целью проведения теста ELISA является определение присутствия или отсутствия определенного белка в образце и его количественная оценка. Существует два способа реализации теста. В одном из них определяется количество антител в образце, а в другом – количество белка, связанного антителами. Их различие заключается в том, хочет ли исследователь подсчитать антитела, либо какой-либо другой белок. В данном случае рассмотрен вариант ELISA для расчета конкретного антитела в образце крови. Тест ELISA выполняется в 96-ячеистых чашках, с помощью которых можно получить высокую точность. Дно каждой лунки покрыто белком, с которым будет связываться анализируемое антитело. Крови позволяют свернуться, и клетки центрифугируют до появления прозрачной сыворотки с антителами (первичные антитела). Сыворотка инкубируется в лунках, в каждой из которых её тип различен. В 96 лунках располагаются сыворотки для позитивного и негативного контроля. Через некоторое время сыворотка удаляется, и слабо прикрепленные антитела вымываются сериями буферных растворов. Для определения связанных антител в каждую лунку вносятся вторичные антитела. Они обычно производятся у кроликов и связываются со всеми человеческими антителами. К вторичному антителу крепится фермент, пероксидаза или щелочная фосфатаза. Он метаболизирует неокрашенные вещества (хромагены) в окрашенные продукты. После инкубации раствор с вторичным антителом удаляется, и потерявшие липкость единичные молекулы также вымываются. Финальный этап включает добавление фермента с образование окрашенных продуктов в лунках со связанными вторичными антителами. Когда ферментативная реакция завершена, чашку помещают в (сканирующий) спектрофотометр для прочтения планшетов, и для каждой лунки определяется оптическая плотность (т.е. количество окрашенного продукта). Эта плотность будет пропорциональна количеству первичных антител, связанных с белками на дне лунки.

Dot ELISA
Dot-ELISA (Иммуноферментный анализ) активно используемый иммунологический инструмент, как в научной работе, так и в аналитической/диагностической лаборатории. В этом анализе антиген располагается в сэндвиче, непосредственно между двумя антителами, которые реагируют с двумя различными эпитопами одного антигена. Одно из антител иммобилизовано на жесткую основу, а второе связано с ферментом. В образце антиген сначала реагирует с иммобилизованным антителом, а затем с фермент-связанным. Количество фермента у связанного с антигеном антитела оценивают после инкубации полосы с соответствующим количеством хромагенного вещества, которое переходит в нерастворимы окрашенный продукт. Окончательные участники в полосе в области ферментативной активности получили название Dot-ELISA. Ферментативная активность оценивается по интенсивности пятна, которая пропорциональна концентрации антигена.

Тест на агглютинацию с помощью латексных шариков
Тест на агглютинацию с латексными шариками относится к лабораторным методам проверки наличия определенных антител или антигенов в жидкостях организма, например, слюне, моче, спинномозговой жидкости или крови. Антитело или антиген прикреплен к поверхности латексной частицы, именуемой активированным латексом. Когда образец, содержащий специфический антиген или антитело смешивается с молочного цвета латексными частицами, происходит агглютинация.

Флуоресцентный тест с антителами
В этом лабораторном методе для определения присутствия микроорганизмов используют антитела, меченные флуоресцентной меткой. Он позволяет непосредственно наблюдать антигенные структуры за счет флуоресцентного индикации комплексов антиген-антитело. Так как целью метода является обнаружение антигенов в субстрате образцов пациента (клеточный мазок, жидкость или культуральная среда на основе клеток пациента) прямая реакция флюоресцирующих антител редко оценивается количественно.
——