Для идентификации различных бактерий используются биохимические тесты.

Индол тест

Анализируемые организмы инокулируют в триптоновую питательную среду, богатый источник аминокислоты триптофана. Индол позитивные бактерии, например, Escherichia coli выделяют триптофаназу, фермент, расщепляющий трптофан, при этом продуцируя индол и другие продукты. Когда в питательную среду с индолом вносится реактив Ковача (пара-диметиламинобензальдегид), раствор становится фиолетового цвета. Индол тест должен поводиться в течение 48 часов инкубации, потому что индол подвергается дальнейшему разрушению. Кислая среда, создаваемая Escherichia coli, ограничивает развитие палочки.

Анализ с метиловым красным и реакция Фогеса — Проскауэра (ФП)

Тесты с метиловым красным (МК) и реакция Фогеса – Проскауэра анализируются после инакуляции в один МК-ФП бульон. После 24-48 часов инкубации МК-ФП бульон разливается в две пробирки. Одна из них используется для теста с метиловым красным, а другая для проведения реакции Фогеса – Проскауэра. Среда содержит глюкозу и пептон. Все представители семейства Enterobacteriaceae окисляют глюкозу для получения энергии, однако состав конечных продуктов зависит от бактериальных ферментов. Как МК, так и ФП используются для определения конечного продукта. E. coli относится к бактериям, которые продуцируют кислоты, вызывая снижение pH среды до 4.4 единиц. Когда индикатор pH метиловый красный вносится в кислый бульон, раствор становится вишнево-красным (положительный МК тест). Представители рода Klebsiella и Enterobacter продуцируют из глюкозы более нейтральные продукты (этиловый спирт, ацетил метил карбинол). При нейтральном значении pH развитие бактерий не ингибируется, поэтому они начинают поглощать пептон, вызывая возрастание pH до 6.2. В этих условиях метиловый красный становится желтым (отрицательный МК тест).

Реагентами для реакции Фогеса – Проскауэра выступают альфа-нафтол и гидроксид калия. Когда эти реагенты вносятся в бульон, в котором присутствует ацетил метил карбинол, раствор становится розоватым (положительный ФП тест). Окраска развивается через 20-30 минут.

Тест на каталазу

Каталаза это фермент, расщепляющий перекись водорода (H2O2) на воду и молекулярный кислород. Перекись водорода часто используется для дезинфекции ран, и пузырение раствора обусловлено образованием кислорода. Перекись водорода является мощным окислителем, который сеет хаос в клетки, поэтому у клеток должна быть система её расщепления. Одна из таких систем включает фермент каталазу.

Тест утилизации цитрата

В данном анализе используется среда с агаром и цитратом Симмонса для определения способности бактерий поглощать цитрат с выделением углерода и энергии. Среда Симмонса содержит бротимол синий, индикатор pH с диапазоном чувствительности 6.0-7.6. Бротимол синий становится желтым в кислой среде (pH около 6) и постепенно переходит в синий в щелочной среде (pH 7.6). Интактная агарозная среда Симмонса имеет pH 6.9 и зеленоватую окраску. Развитие бактерий приводит к посинению (положительная реакция на цитрат). Роды Enterobacter и Klebsiella дают положительную реакцию на цитрат, в то время как E.coli – отрицательную.

Тест на оксидазу

Тест на оксидазу определяет бактерий, которые способны продуцировать фермент цитохромоксидазу. данный фермент участвует в транспорте электронов от молекулы донора до кислорода. Реагент оксидазы включает хромогенный компонент, который меняет цвет при окислении. Если тестовый организм продуцирует цитохромоксидазу, оксидазный реагент в течение 15 секунд из синего переходит в пурпурный.

Нитрат-редуктазный тест

Бульон с нитратом используется для определения способности организмов переводить нитрат (NO3) в нитрит (NO2) с использованием фермента нитратредуктазы. Он также обнаруживает организмы, участвующие в процессах нитрификации, перерабатывающих нитрат и нитрит в молекулярный азот. Бульон содержит питательные вещества и нитрат калия в качестве источника нитрата. После инкубации в среду по каплям вносится сульфаниловая кислота и a-нафтиламин. Если микроорганизмы переводят нитрат в нитрит, нитриты в среде начинают образовывать азотистую кислоту. Когда вносится сульфаниловая кислота, она реагирует с азотистой кислотой с образованием диазотированный сульфаниловой кислоты. Последняя, в свою очередь, вступает реакцию с a-нафтиламином с образованием красного вещества. Поэтому, если среда становится красной после добавления нитрата, нитрат-редуктазная реакция считается положительной. Если среда не приобретает красный оттенок, считается, что бактерии не способны утилизировать нитрат, либо они утилизируют нитрат и нитрит с образованием аммония или молекулярного азота. Второе обстоятельство требует проведения дальнейшего анализа. В не окрасившуюся в красный цвет среду добавляют небольшое количество порошкообразного цинка (он вреден для здоровья, обращайтесь аккуратно!). Если пробирка все-таки окрасилась в красный после добавления цинка, значит, нитрат присутствует (отрицательный результат на нитрат-редуктазную реакцию). Цинк переводит нитрат в нитрит, который образует азотистую кислоту, взаимодействующую с сульфаниловой кислотой. Отсутствие красного окрашивания после добавления цинка свидетельствует об отсутствии нитрата в растворе и, соответственно, о положительном результате на нитрат-редуктазную реакцию. После проведения второго этапа тестирования становится ясно, что нитрита нет в среде, либо конечными продуктами денитрификации являются аммоний и молекулярный азот.

Уреазный тест

Уреазный бульон представляет собой дифференциальную среду для проверки способности организмов продуцировать экзофермент, известный как уреаза. Уреаза гидролизует мочевину до аммония и углекислого газа. Бульон содержит два pH буфера, мочевину, очень небольшое количество питательных веществ для бактерий, а также индикатор pH феноловый красный. Феноловый красный становится желтым в кислой среде и красновато-пурпурным в щелочной среде. Если мочевина в бульоне расщепляется до аммония, среда приобретает щелочную реакцию и становится розовой. Многие энтеробактерии гидролизуют мочевину, но не многие делают это быстро. Существует группа, так называемых, «быстрых мочевина-позитивных» бактерий. В неё, в частности, входят члены рода Proteus. Уреазный тест используется специально для быстрых мочевина-позитивных микроорганизмов. Присутствие ограниченного количества питательных веществ и pH буферов препятствует развитию всех организмов, но быстрые мочевина-позитивные бактерии успевают продуцировать достаточное количество аммония для реакции с феноловым красным.

Бульон с феноловым красным

Бульон с феноловым красным является дифференциальной средой, обычно используемой для определения грамотрицательных энтеробактерий. Она содержит пептон, феноловый красный (pH индикатор), пробирку Дюрхама и один углевод. Например, можно использовать три различных типа бульона с феноловым красным. Один содержит глюкозу, второй – лактозу, а третий – сахарозу. Целью анализа является определения типа углевода, который утилизирует конкретный тип бактерий. Феноловый красный является pH индикатором, который становится желтым при pH ниже 6.8 и пурпурно-красным при pH 7.4. Если микроорганизмы утилизируют предложенный углевод, начинают продуцироваться кислые продукты метаболизма, и среда становится желтой. Если бактерии не способны поглощать углевод, они начинают использовать пептон, выделяя аммоний, который повышает pH среды (становится красной). Иногда при использовании углеводов бактерия продуцирует газообразные продукты. В этом случае в пробирке Дюрхама будут наблюдаться пузырьки газа.

Казеазный тест

Агар на основе снятого молока представляет собой дифференциальную среду, предназначенную для проведения тестов на способность микроорганизмов продуцировать экзофермент – казеазу. Данный фермент гидролизует казеин. Казеин формирует непрозрачную взвесь молока, придавая ему белый цвет. Казеаза позволяет организмам расщеплять казен до мелких молекул полипептидов, пептидов и аминокислот, которые проникают через клеточную мембрану и используются клеткой. Когда казеин полностью расщепляется, утрачивается белая окраска. Если микроорганизмы способны расщеплять казеин, на границе роста культуры отмечается прозрачный ореол.

Тест определения желатиназной активности

Дифференциальная среда с желатином в качестве нутриента предназначена для определения способности бактерий вырабатывать фермент – желатиназу, которая гидролизует желатин. Желатин общеизвестен как компонент желатинизированных салатов и некоторых десертов. Он является белком, получаемым из соединительной ткани животных. При температуре ниже 32 °C он принимает полужидкое состояние, а при температуре более 32 °C — состояние вязкой жидкости. Желатиназа позволяет микроорганизмам расщеплять желатин до полипептидов, пептидов и аминокислот, которые проникают в мембрану и используются клетками. Когда бактерии поглощают желатин, пограничная с колонией область желатина остается жидкой, не смотря на то, что он охлажден.

Тест липазной активности

Агар с глицерилтрибутиратом предназначена для определения способности бактерий вырабатывать фермент – липазу, которая гидролизует трибутирин. Липазы расщепляют липиды (жиры). Трибутирин является липидом триглицеридом. Другие тесты на утилизацию липидов в качестве источников жиров используют кукурузное, оливковое масло, яичный желток и масло соевых бобов. Липазы позволяют организмам расщеплять липиды на более мелкие компоненты. Триглицериды состоят из глицерина и жирных кислот. Эти вещества переводятся в различные конечные продукты, которые используются клеткой в качестве источника энергии и для других процессов. Трибутирин формирует непрозрачную взвесь в агаре. Когда микроорганизмы расщепляют его, вдоль границы колонии виден прозрачный ореол.

Реакция гидролиза крахмала

Крахмальный агар является дифференциальной средой, которая используется для определения организмов, продуцирующих ферменты α-амилазу и олиго-1,6-глюкозидазу, гидролизующие крахмал. Молекулы крахмала слишком большие для проникновению в бактериальную клетку, поэтому бактерии расщепляют его на мелкие компоненты. Крахмальный агар является простейшей питательной средой с введенным в неё крахмалом. Так как утилизация крахмала не ведет к изменению окраски среды, после инкубации в качестве индикатора вводят йод. В присутствии крахмала йод становится синим, фиолетовым или черным (в зависимости от его концентрации). Отсутствие окрашивания вдоль границы колонии свидетельствует об амилазной активности.

Тест с трехсахарным железосодержащим агаром

Трехсахарный железосодержащий агар является дифференциальной средой, которая содержит лактозу, сахарозу, небольшое количество глюкозы (декстроза), сульфата железа и pH индикатор феноловый красный. Она используется для дифференцировки энтеробактерий на основе их способности снижать содержание серы и сбраживать углеводы. В присутствии фенолового красного, если бактерии сбраживают какой-либо из трех сахаров, среда окрашивается в желтый цвет. Если микроорганизмы сбраживают только декстрозу, её небольшое количество будет израсходовано уже через 10 часов инкубации. По истечении этого времени реакция, в результате которой продуцировалась кислота, меняет направление в аэробную сторону. Поэтому среда становится щелочной и красной. Анаэробные области скошенного агара, например, на дне, остаются желтыми. Это наблюдается при культивировании бактерий рода Salmonella и Shigella.

Тест с декарбоксилированием

Питательная среда на присутствие декарбоксилазы специально готовится для проверки продукции данного фермента, который удаляет карбоксильные группы у аминокислот. Бульон на присутствие декарбоксилазы содержит питательные вещества, декстрозу (поддающийся ферментации углевод), пиридоксаль (фермент кофактор для декарбоксилазы) и pH индикатор бромкрезоловый пурпурный и крезол красный. Бромкрезоловый пурпурный становится пурпурным в щелочной среде и желтым в кислой. В каждую среду добавляется определенная аминокислота (аргинин, лизин или орнитин). Тест пригоден для дифференцировки представителей семейства Enterobacteriaceae. Каждая декарбоксилаза, продуцируемая определенным микроорганизмом, специфична для аминокислоты, на которую она вырабатывается. Поэтому используются схожие среды на определение аргининовой, лизиновой или орнитиновой декарбоксилаз. Если бактерия не может утилизировать декстрозу, окраска среды не меняется. В противном случае, выделяются кислые продукты, и среда становится желтой. С началом брожения декстрозы окраска приобретает желтоватый оттенок, даже в случае инокуляции декарбоксилаза-положительных микроорганизмов. Низкое значение pH и присутствие аминокислот заставляет бактерии приступить к декарбоксилированию. Если микроорганизм способен отщеплять карбоксильные группы от аминокислот, образуются щелочные субпродукты. Аргинин гидролизуется до орнитина, а затем декарбоксилируется. Орнитин декарбоксилируется до путресцина. а лизин до кадаверина. Эти производные существенно повышают pH среды, поэтому индикатор демонстрирует пурпурную окраску. Если после инокуляции среды не изменила цвет или осталась желтой, организмы считаются декарбоксилаза-негативными к выбранной аминокислоте. В противном случае (смена окраски на пурпурную), они являются декарбоксилаза-позитивными к выбранной аминокислоте.

Тест на коагулазную активность

Коагулазный тест определяет способность микроорганизма продуцировать коагулазу, которая вызывает коагуляцию (свертывание) фибрина плазмы крови. Выделяющие коагулазу бактерии могут формировать барьер из фибрина, защищающий их от фагоцитоза и других типов иммунного ответа. Для определения наличия связанных коагулаз или факторов свертывания, связанных с клеточной стенкой бактерии, используется коагулазный тест с предметным стеклом. Связанные коагулазы реагируют с фибриногеном плазмы, вызывая осаждение фибриногена. Это приводит к агглютинации клеток и образованию комка. Возможно, потребуется расположить предметное стекло в проходящий свет, чтобы увидеть слипание клеток. Для упрощение часто используется коагулазный тест в пробирке. Он позволяет идентифицировать присутствие связанных коагулаз, либо свободных коагулаз, которые являются внеклеточными ферментами. Свободные коагулазы реагируют с компонентами плазмы, известными как коагулаза-реактивные факторы. В результате происходит коагуляция плазмы. В упрощенной версии теста в пробирке инокуляция Staphylococcus aureus приводит к образованию сгустков, а и Staphylococcus epidermidis – нет (инкубация при 37°C в течение 24 часов). данный метод применим для идентификации потенциально патогенных Staphylococci, таких как Staphylococcus aureus (грамположительные, коагулазо-позитивные кокки).
——
[user]по материалам: Arun Sudhagar S, Ezhil Nilavan S, Linga Prabu D, Rathi Bhuvaneswari G, Chandrasekar S and Rajesh kumar R. Diagnostic Tools Used in Fish Disease Diagnosis. Central Institute of Fisheries Education, Mumbai
aquafind.com/articles/FishDiseaseDiagnosis.php

K Riji John & Rosalind George, 2004, Fin Fish & Shell Fish Diseases (Practical Manual). Fisheries College & Research Institute, Thoothukudi.
S Felix, Riji John, Prince Jeyaseelan & V Sundararaj, 2001, National Traning Course On Fish Disease Diagnosis & Health Management, Fisheries College & Research Institute, Thoothukudi.
K M Shankar & C V Mohan, 2002, Fish And Shellfish Health Management, College Of Fisheries, Mangalore.
Ilhan Altinok & Ilknur Kurt, 2004, Molecular Diagnosis Of Fish Diseases: A Review, Turkish Journal Of Fisheries And Aquatic Sciences 3: 131-138
National Standard Methods, Center For Infection, Wales.
Erlich, H.A. PCR Technology Principles And Applications For DNA Amplification. Stockton Press, New York, 1989.
PCR Technology: Current Innovations, 2nd Edition. Edited By Thomas Weissensteiner Et Al.
Edawards K., Logan J., Saunders N. (Eds.). 2004. Real-Time PCR: An Essential Guide. Horizon Bioscience, Norfolk, UK, P. 346.
Durand S.V., Lightner D.V. 2002. Quantitative Real Time PCR For The Measurement Of White Spot Syndrome Virus In Shrimp. J. Fish Dis. 25, 381-389.
La Fauce K.A., Layton R., Owens L. 2007. Taqman Real-Time PCR For Detection Of Hepatopancreatic Parvovirus From Australia. J. Virol. Methods, 140, (1-2), 10-16.
Mouillesseaux K.P., Klimpel K.R., Dhar A.K. 2003. Improvement In The Specificity And Sensitivity Of Detection For The Taura Syndrome Virus And Yellow Head Virus Of Penaeid Shrimp By Increasing The Amplicon Size In SYBR Green Real-Time RT-PCR. J. Virol. Methods, 111 (2), 121-127.
Rajendran K.V., Jeff A. Cowley, Russell J. Mcculloch, Peter J. Walker. 2006. A Taqman Real-Time RT-PCR For Quantifying Mourilyan Virus Infection Levels In Penaeid Shrimp Tissues. J. Virol. Methods 137, 265-271.
Tang K.F., Wang J., Lightner D.V. 2004. Quantification Of Taura Syndrome Virus By Real-Time RT-PCR With A Taqman Assay. J. Viro. Methods 11, 109-114.
[/user]